抗Bt小菜蛾的选育、受体基因克隆及PTD对CrylAc的增效作用

摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,在世界范围内得到广泛的应用.编码Bt杀虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫基因转入到了多种重要的粮棉作物中,在害虫防治中起着巨大的作用.小菜蛾(Plutellaxylostella(L.))是十字花科蔬菜的主要害虫,也是最早在田间发现已对Bt产生抗性种群的害虫.该文用Bt制剂和Cry1Ac毒蛋白对小菜蛾进行了室内抗性选育研究,并对抗性与敏感小菜蛾种群的相关生物学性状及生物适合度进行系统分析.在此基础上,完成了抗性和敏感小菜蛾Bt受体蛋白基因的克隆和序列比对分析,为进一步在基因水平上阐明Bt抗性的分子机理奠定了基础.蛋白转导结构域(PTD-Protein Transduction Domain)是一类能自动穿透细胞膜,并能作为载体将其它生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽.该实验首次将PTD作为载体携带大分子物质透过细胞膜的特性应用于杀虫蛋白领域,通过PTD与Bt杀虫蛋白融合基因及其表达载体的构建、融合蛋白的分离纯化和生物活性测定明确了PTD对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的增效作用和对抗性害虫的克抗作用.主要结果如下:经过室内筛选,获得对Cry1Ac毒蛋白和Bt抗性倍数分别为24.36和38.16倍的小菜蛾抗性种群.对抗性与敏感小菜蛾种群的生长发育、存活及繁殖特征的研究表明:抗性种群较敏感种群产卵量和孵化率下降,幼虫发育历期延长,雌雄比显著降低,雌成虫数量、寿命减少.小菜蛾对Bt和Cry1Ac抗性的产生以牺牲相对适合度为代价,抗性种群在繁殖能力上存在明显的生存劣势.利用RT-PCR结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了Bt受体编码基因,共克隆了小菜蛾3个类群的5个APN基因,并比较编码小菜蛾敏感种群、抗Bt种群、抗Cry1Ac种群APN2的核苷酸及推导的氨基酸序列.结果表明,抗Bt种群的APN2与敏感种群有差别的氨基酸突变点有8处;抗Cry1Ac种群的APN2与敏感种群有差别的氨基酸突变点有15处.首次利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)对小菜蛾的类钙粘蛋白基因cDNA片段进行了克隆和序列分析.通过简并性引物扩增出了小菜蛾类钙粘蛋白基因427bp的cDNA片段.同源性分析表明,该cDNA片段与其它昆虫类钙粘蛋白基因序列具有较高的同源性.按PTD-Cry1Ac-6His顺序,合成11个氨基酸TatPTD和17个氨基酸RevPTD核苷酸双链,成功设计构建了PTD-Cry1Ac融合表达载体.对构建的融合表达载体进行诱导、表达和纯化,以小菜蛾Bt敏感和抗性种群进行生物测定.生测实验表明,PTD对Bt杀虫蛋白Cry1Ac具有明显的增效作用,特别是对抗性种群,带有Tat和Rev转导肽的融合蛋白杀虫活性明显增强.对敏感小菜蛾种群,Tat和Rev的增效倍数分别为4.84、1.29倍;对抗性小菜蛾种群,增效倍数分别为9.69、4.99倍.该项目在国际上首次将PTD应用于农业研究领域,并证实PTD对微生物杀虫剂具有显著的增效作用并对抗性小菜蛾具有明显的克抗作用.开辟了PTD应用的新领域并为克服害虫抗药性提出了新途径.

目录

文摘

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第一章绪论

1.1 Bt研究进展

1.1.1 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能关系

1.1.2 Bt杀虫机理

1.1.3害虫对Bt的抗性发展

1.2 Bt受体蛋白与昆虫抗性的研究概况

1.2.1 Bt受体蛋白的分离鉴定

1.2.2 Bt受体蛋白与抗性产生的关系

1.2.3小菜蛾结合位点模型

1.2.4毒素受体蛋白基因序列特征

1.3蛋白转导研究最新进展

1.3.1 PTD的发现

1.3.2 PTD的转导机制

1.3.3 PTD融合分子制备

1.3.4 PTD应用概述

1.4研究目的意义

1.4.1研究目的

1.4.2研究意义

1.4.3研究内容

第二章小菜蛾室内继代饲养和抗性选育

2.1小菜蛾人工继代饲养技术研究

2.1.1材料和方法

2.1.2结果和分析

2.1.3小结和讨论

2.2 Cry1Ac毒蛋白和Bt制剂对小菜蛾的抗性选育及生物学参数影响

2.2.1材料与方法

2.2.2结果与分析

2.2.3讨论

2.3 Bt对抗性及敏感小菜蛾拒食活性研究

2.3.1材料与方法

2.3.2结果与分析

2.3.3小结与讨论

第三章小菜蛾Bt毒素受体蛋白基因的克隆及序列分析

3.1材料和方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1编码APN1的基因克隆、鉴定及序列分析

3.2.2编码APN2的基因克隆、鉴定及序列分析

3.2.3编码APN4的基因克隆、鉴定及序列分析

3.2.4编码类钙粘蛋白基因的克隆、鉴定及序列分析

3.3 讨论

第四章PTD与Cry1Ac基因融合载体构建及表达

4.1实验材料及相关仪器

4.1.1菌株与质粒

4.1.2试剂、培养基与主要缓冲液

4.1.3培养基

4.1.4仪器设备

4.1.5供试昆虫

4.2实验方法

4.2.1引物设计和合成

4.2.2 Cry1Ac基因模板制备

4.2.3 Cry1Ac结构域基因的PCR扩增

4.2.4 PCR及酶切产物的纯化、回收

4.2.5 PTD、Cry1Ac与pET-21b载体的连接

4.2.6大肠杆菌CaCl2感受态细胞制备

4.2.7连接产物转化

4.2.8提取质粒DNA

4.2.9酶切及PCR检测

4.2.10序列测定及分析

4.2.11融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达

4.2.12 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoreses)凝胶电泳检测

4.2.13表达蛋白的免疫检测

4.2.14蛋白纯化

4.2.15融合蛋白的毒力测定

4.3结果与分析

4.3.1 PTD-Cry1Ac融合表达载体构建

4.3.2融合蛋白的表达纯化

4.3.3融合蛋白的活性测定

4.4讨论

第五章结论

参考文献

致谢

附录

作者简历