抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究及其与干扰素IFNa-2b融合表达载体的构建

摘要

抗菌肽(ABP)是一种具有广谱抗菌活性的小肽类物质。研究表明，除了抗菌活性外，抗菌肽还具有抗病毒、抗真菌和抗肿瘤作用。干扰素(interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，而且还有抑制肿瘤增殖、抗纤维化以及免疫调节等功能。　　在已有高效表达融合蛋白ABPS1-GFP的基因工程菌的基础上，对融合蛋白的纯化条件进行了初步研究。首先将高效表达抗菌肽ABPS1的工程菌扩大培养，诱导表达后所得的菌体离心后进行冰浴下超声裂解，继而用表面活性剂TritonX-100和低浓度的尿素对包涵体进行充分洗涤，接着用高浓度的尿素裂解包涵体，然后在变性条件下对融合蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化，最后采用尿素梯度透析法对变性蛋白进行复性，并对包涵体变性、复性等条件进行了初步优化。　　然而，将融合蛋白ABPS1-GFP裂解获得抗菌肽ABPS1的蛋白单体，必须使用化学裂解剂CNBr。CNBr是一种剧毒化学物质，很难购买；而且在基因工程产品的生产中，禁止使用CNBr。为此，对此表达载体进行了改造，构建了含有1个IFNα-2b基因和2个ABPS1基因的融合表达载体。首先在基因水平上，通过PCR的方法在各单体分子之间引入凝血因子Xa切割位点的识别序列，以质粒pET-28b(+)为载体，利用同裂酶BamHI与BglⅡ可以切出相同粘性末端的特性，通过酶切、连接、转化等操作，构建干扰素和抗菌肽的融合表达载体。经PCR、双酶切和DNA测序分析表明，串联体的DNA序列及阅读框完全正确。将干扰素IFNα-2b基因和抗菌肽ABPS1基因融合在一起，在大肠杆菌中进行表达，通过纯化后裂解可以同时获得这两种蛋白，为将ABPS1和IFNα-2b单独或联合应用于临床和生产实践奠定基础。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一部分：文献综述

1.1抗菌肽研究进展

1.1.1抗菌肽的种类

1.1.2抗菌肽的生物学作用

1.1.3抗菌肽的结构和作用机理

1.1.4抗菌肽基因工程

1.1.4抗菌肽的应用前景

1.2干扰素的研究进展

1.2.1干扰素的产生及分类

1.2.2干扰素的生物学作用

1.2.3干扰素的分子结构

1.2.4干扰素基因工程

1.2.5干扰素的应用

1.3包涵体蛋白的提取纯化

1.3.1包涵体的初步纯化

1.3.2包涵体蛋白的精制纯化

1.3.3包涵体提纯条件的优化

第二部分：实验内容

实验一、基因工程抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

实验二、抗菌肽ABPS1与干扰素INF-α-2b融合表达载体的构建

1.1材料和方法

2.2结果与分析

1.3讨论

结 论

参考文献

致谢