一个新的拟南芥微管结合蛋白——AtMAP18的功能分析

摘要

本文对一个新的拟南芥微管结合蛋白——AtMAP18的功能进行了分析研究。文章通过克隆，原核表达，并纯化了该蛋白。为了研究AtMAP18的基因表达模式，构建了AtMAP18启动子-GUS质粒，并转化拟南芥植株；为了研究AtMAP18的生理功能，构建相应的质粒转化拟南芥，筛选获得AtMAP18过表达和RNAi转基因植株的纯合体株系。文章进一步对AtMAP18对细胞中微管骨架的作用进行了研究。对AtMAP18过表达植株中子叶铺板细胞微管和下胚轴表皮细胞微管观察显示，微管的排列即微管列阵与野生型的相比发生改变。AtMAP18过量表达使微管列阵的动态转换被抑制，导致细胞形态的改变。本研究证明了AtMAP18是一个新发现的植物细胞微管结合蛋白，并对AtMAP18的生理功能进行了分析；证明了AtMAP18在对细胞微管骨架的组织和调控方面有作用，并进一步在植物细胞生长的调控和形态建成方面有重要的功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

1.1 微管骨架

1.1.1 微管的基本结构

1.1.2 微管蛋白

1.1.2 微管的动力学特性

1.2 植物微管

1.2.1 植物细胞中微管生长的动态特征

1.2.2 植物细胞的微管列阵

1.3 植物微管结合蛋白

1.3.1 MOR1(Microtubule Organization 1)和TMBP200

1.3.2剑蛋白(Katanin)

1.3.3 SPR1(SPIRAL 1)

1.3.4 EB1(End Binding 1)

1.3.5 MAP65家族

1.3.6 磷脂酶D(PLD)和胁迫诱导的脂类信号

1.4 植物中微管骨架与细胞形态

第二章拟南芥AtMAP18体外结合微管

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 原核表达菌株的转化与筛选

2.2.3 AtMAP18诱导表达与纯化

2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记

2.2.5 猪脑微管蛋白的纯化及荧光标记

2.2.6 蛋白质浓度测定

2.2.7 蛋白质纯度鉴定

2.2.8 共沉淀实验

2.2.9 AtMAP18的荧光标记

2.3 结果与分析

2.3.1 AtMAP18基因的克隆和原核表达载体的构建

2.3.2 pGEX-4T-AtMAP18原核表达载体的鉴定

2.3.3 AtMAP18的核苷酸测定及氨基酸序列分析

2.3.4 AtMAP18蛋白的纯化

2.3.5 猪脑微管蛋白的纯化

2.3.6 AtMAP18体外结合微管

2.3.7 Alexa FluorR488标记的AtMAP18结合微管的荧光观察

2.4 讨论

第三章AtMAP18对微管聚合的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 浊度法

3.2.2 荧光镜观察AtMAP18对微管聚合的影响

3.2.3 EDC交联

3.2.4超薄切片

3.3 结果与分析

3.3.1 AtMAP18对微管聚合的影响

3.3.2 AtMAP18影响微管聚合的荧光观察

3.3.3 AtMAP18不结合微管蛋白单体

3.3.4 荧光镜观察AtMAP18对微管成束的影响

3.3.5 电镜观察AtMAP18抑制微管聚合

3.4 讨论

第四章AtMAP18的组织定位和亚细胞定位

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 AtMAP18抗体制备及纯化

4.2.2 拟南芥不同组织的免疫印记

4.2.3 拟南芥根的免疫荧光观察

4.2.4 AtMAP18启动子活性的组织特异性

4.2.5 pCAMBIA1300-RFP-AtMAP18转化野生型(Columbia ecotype)和GFP-α-tubulin拟南芥

4.3 结果分析

4.3.1 AtMAP18抗体纯化和效价检测

4.3.2 抗体分析AtMAP18在拟南芥的表达

4.3.3 AtMAP18启动子活性的组织特异性

4.3.4 AtMAP18的亚细胞定位

第五章AtMAP18基因过表达和抑制植株的表型观察

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 RT-PCR检测AtMAP18基因过表达株系和抑制株系

5.2.3 Western blotting检测AtMAP18基因过表达株系和抑制株系

5.2.4 AtMAP18基因过表达株系和抑制株系纯合体的筛选

5.2.5 Spurr's树脂半薄切片

5.2.6扫描电镜观察

5.3 结果与分析

5.3.1 转AtMAP18基因过表达和抑制纯合体的筛选

5.3.2 AtMAP18过表达和抑制的RT-PCR和Western blot鉴定

5.3.3 AtMAP18基因过表达和抑制株系的花粉观察

5.3.4 AtMAP18基因过表达和抑制株系根的观察

5.3.5 AtMAP18基因过表和抑制株系叶的观察

5.3.6 AtMAP18基因过表达和抑制子叶的观察

5.3.7 AtMAP18基因过表达下胚轴的观察

5.3.8 AtMAP18基因过表达表皮毛的观察

5.4 讨论

第六章AtMAP18通过调控周质微管列阵参与细胞形态建成

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 野生型和AtMAP18过表达根的免疫荧光

6.2.3 AtMAP18过表达植株与GFP-Tubulin拟南芥植株杂交

6.2.4 Taxol处GFP-Tubulin和AtMAP18过表达拟南芥

6.2.5 Orzalin处GFP-Tubulin和AtMAP18过表达拟南芥

6.3 结果与分析

6.3.1 AtMAP18过表达植株根的微管观察

6.3.2 AtMAP18过表达植株子叶和下胚轴的表皮细胞微管观察

6.3.3 Taxol处理后野生型和AtMAP18过表达子叶铺板细胞微管观察

6.3.4 Taxol处理后野生型和过表达下胚轴表皮细胞微管观察

6.3.5 Orzalin处理后野生型和过表达微管观察

6.4 讨论

第七章结论

参考文献

致谢