转细胞凋亡抑制基因水稻抗纹枯病和烂秧病研究

摘要

本研究为了获得具广谱和持久抗性的水稻新种质，抵抗坏死营养型病原菌诱发的多种病害和生产过程中的多种逆境，利用农杆菌介导转化法首次将来源于昆虫杆状病毒的细胞凋亡抑制基因Op-iap和p35导入水稻中。 依目的基因编码区序列设计了三对引物，从昆虫表达载体pIE1-4opiap和pIE1-4p35中扩增了细胞凋亡抑制基因iap和p35。Op-iap基因的编码区长807bp，编码一个由268个氨基酸组成的，分子量约为30kDa具有抑制细胞凋亡功能的蛋白；p35基因长为900bp，编码一个由299个氨基酸组成的，分子量约为35kDa的具有抑制细胞凋亡功能的蛋白。将两个基因单独及其组合分别插入pCAMBIA1301，构建了三个植物表达载体p1301-iap、p1301-p35和p1301-iap-p35，经PCR检测、酶切鉴定和核苷酸序列测定等分析确认构建无误。 利用农杆菌介导转化法通过构建的载体将目的基因和对照(gus基因)导入粳稻品种“中花8号”、“中花10号”和“Aichiasahi”，共获得转基因水稻485株。经Southern-blot、Northern-blot和RT-PCR分析，导入的基因已整合到转基因植株的基因组中，并转录了完整的mRNA。利用PCR扩增结果对T1代的外源基因分离进行了遗传分析，结果表明：目的基因在T1代中符合孟德尔分离比例，并与选择标记基因紧密连锁。 接种立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)并调查转基因水稻的发病级别，计算平均病级及病情指数。接种20天时，提取病斑周围组织的DNA，经2％琼脂糖凝胶电泳，观察细胞凋亡的典型标志DNA片段化。观察、计算及统计分析结果显示，导入了细胞凋亡抑制基因的“中花8号”T0代植株能够抑制坏死营养型病原真菌侵染诱发的细胞凋亡，显著地提高了受体品种对稻纹枯病的抗性。 转细胞凋亡抑制基因水稻的T1代幼苗能够抑制在低温、弱光、短日照等不良环境条件下由立枯丝核菌(Rhizoctonisolani)侵染诱发的细胞凋亡，显著地提高了秧苗的存活率和抗烂秧病能力。 对含有p35基因的“Aichiasahi”T0植株分别接种稻瘟菌(Magnaporthegrisea)的亲和性小种MS220及和非亲和性小种131，初步研究的结果表明，细胞凋亡抑制基因对稻瘟病的致病性及发病级别没有显著影响。 转基因水稻的种子萌发、形态建成、繁殖过程正常，未受到细胞调亡抑制基因的显著影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

1.1水稻转基因育种研究进展

1.1.1水稻转基因技术的进步

1.1.2水稻转基因育种的研究进展

1.2水稻抗病转基因研究进展

1.2.1水稻抗真菌病害转基因研究

1.2.2水稻抗细菌病害转基因研究

1.2.3水稻抗病毒病害转基因研究

1.2.4水稻抗纹枯病转基因研究

1.3细胞凋亡抑制与抗病育种

1.3.1植物细胞凋亡研究进展

1.3.2细胞凋亡抑制与抗病育种

1.4选题依据与意义

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2基因

2.1.3菌株和载体

2.1.4酶及试剂

2.1.5引物设计

2.1.6培养基

2.2研究方法

2.2.1基因的克隆和鉴定

2.2.2双酶切质粒与目的片段的回收

2.2.3单价植物表达载体的构建

2.2.4双价植物表达载体(p1301-iap-p35)的构建

2.2.5植物表达载体转化农杆菌EHA105

2.2.6农杆菌介导的水稻转化和转基因水稻植株的获得

2.2.7转基因水稻的分子检测

2.2.8转基因水稻的抗性检测

第三章结果与分析

3.1细胞凋亡抑制基因iap和p35的PCR扩增

3.2植物表达载体的构建

3.2.1载体的构建

3.2.2载体的鉴定

3.3农杆菌介导的水稻转化和转基因水稻植株的获得

3.3.1植物表达载体转化农杆菌

3.3.2转基因水稻植株的获得

3.4转基因水稻的检测及遗传

3.4.1 T0代转化植株的PCR检测

3.4.2 T0代转化植株的Southern检测

3.4.3 T0代转化植株的RT-PCR和Northern-blot检测

3.4.4 T1代外源基因的遗传分离

3.4.5 T1代幼苗的潮霉素抗性检测

3.5转基因水稻的抗病性分析

3.5.1 T0代转基因植株抗纹枯病的鉴定

3.5.2 T1代转基因幼苗抗烂秧病的分析

3.6结论

第四章讨论

1抗病转基因育种存在的问题及对策

2凋亡抑制与抗病育种

3凋亡抑制与抗逆育种

4凋亡抑制对稻瘟病抗性及发育的影响

参考文献

致谢

附录

Ⅰ、NB基本培养基各类元素含量及贮存液(母液)配制

Ⅱ、iap基因的酶切位点

Ⅲ、p35基因的酶切位点

Ⅳ、pCAMBIA1301的质粒图谱

Ⅴ、pBI121的质粒图谱

Ⅵ、MBI Fermentas DNA Ladder图谱

作者简介