牛流行热病毒G蛋白原核表达及间接ELISA方法的初步建立

摘要

本文根据澳大利亚牛流行热病毒(BEFV)BB7721株的G蛋白基因序列设计引物，利用RT-PCR方法扩增了BEFV北京分离株JB76H的G蛋白基因不含信号肽和跨膜区的部分，并克隆到原核表达载体pET30a中，获得重组质粒。用该重组质粒转化受体菌BL21，以不同浓度IPTG进行诱导，经SDS-PAGE电泳证实克隆的部分G基因获得了表达，表达产物大小约为25ku，且在IPTG浓度为0.6mmol/L、温度为30℃条件诱导下经5h其表达量达到高峰。Western-blot分析证实表达的重组G蛋白具有反应原性，纯化后包涵体中重组蛋白表达量约占74.5％。 将纯化后的重组BEFVG蛋白作为ELISA包被抗原，初步建立了检测牛血清中BEFV抗体的间接ELISA方法，并对ELISA的反应条件进行了摸索，确定了最适工作条件。结果表明，重组蛋白抗原的最适包被浓度为2.5μg/ml，待检血清的稀释度为1∶100，最适包被条件为4℃包被过夜，2％明胶作为封闭液，阴阳性临界值为0.110。经交叉反应实验证实本研究初步建立的间接ELISA方法是特异的。通过对10份经中和试验检测为阳性的血清样品进行检测，间接ELISA方法与中和试验的符合率达90％。

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