巴西固氮螺菌Yu62中与吲哚乙酸合成相关的trpE和atrC基因的功能分析

摘要

巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)Yu62是从北京郊区的玉米(ZeamaysL.cv.Huang3-4)根际中分离获得，该菌即可以固氮，也可以分泌植物激素如吲哚乙酸(IAA)。我室用Tn5转座子随机突变巴西固氮螺菌Yu62获得5个IAA产量降低的突变株。本论文对其中2个突变株中被Tn5插入失活的基因进行了功能分析。 一个突变株A24被Tn5插入失活的基因(trpE)，编码邻氨基苯甲酸合成酶α亚基，这是该菌中首次报道的单独存在的trpE基因，有报道A.brasilenseSp7中也有trpE基因，但它与trpG基因融合。本文通过PCR方法从巴西固氮螺菌Yu62中克隆了trpEG融合基因(记为trpE1(G)，表明巴西固氮螺菌有两个trpE基因，一个与trpG融合，另一个则单独存在(记为trpE2)。比较两个基因的序列可知在trpE1(G)融合基因的读码框上游有可以形成前导肽、终止子和反终止子的序列，而trpE2基因则没有此结构。将两个基因的启动子序列分别与报告基因lacZ相融合，分别转入巴西固氮螺菌Yu62，检测其p-半乳糖苷酶活性。结果表明随着色氨酸浓度的增加，携带有trpE1(G)-lacZ融合质粒的巴西固氮螺菌的β-半乳糖苷酶活性随之降低，而具有trpE2-lacZ融合质粒的相同菌株的酶活则保持平稳，这表明trpE1(G)融合基因的表达通过转录水平上的弱化作用受到色氨酸调控，而trpE2基因则稳定表达，不受其调控。通过同源重组的方法分别构建了两基因单独敲除的突变菌株，将野生型及两个突变菌株中邻氨基苯甲酸合成酶蛋白，分别与底物分枝酸进行反应，以生成产物邻氨基苯甲酸的量来计算该酶的活性。体外催化反应结果表明，trpE1(G)基因的突变株，即trpE2基因编码的邻氨基苯甲酸合成酶的酶活对色氨酸不敏感，而trpE2基因的突变株，即trpE1(G)基因编码产物的酶活受色氨酸的反馈抑制。并且trpE1(G)和trpE2基因均参与色氨酸的生物合成，trpE1(G)和trpE2基因的分别缺失都会影响到IAA的合成，添加一定量的外源色氨酸或邻氨基苯甲酸可以恢复突变菌株的IAA的产量。 另一个IAA产量降低的突变株即A3，其被Tn5插入失活的基因编码的产物与Polaromonassp.JS666的4-氨基丁酸氨基转移酶同源性较高(60％)，因此推测该基因编码氨基转移酶，这是该菌中首次报道的编码氨基转移酶的DNA序列。本文将该基因(atrC)与表达载体pET28a连接，在大肠杆菌BL21中进行表达和纯化，经活性染色鉴定该基因编码的产物AtrC蛋白为氨基转移酶，将纯化出的AtrC蛋白与atrC基因被敲除的突变菌株的总蛋白及色氨酸共同在体外反应，HPLC检测结果显示产物吲哚乙酸的生成，并且不加AtrC蛋白的反应没有检测到产物吲哚乙酸，表明纯化出的AtrC蛋白参与吲哚乙酸的合成，推测其负责细菌合成IAA的吲哚丙酮酸途径的第一步催化反应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章巴西固氮螺菌Yu62 trpE基因的初步研究

第三章AtrC蛋白的功能分析

结论

参考文献

致谢

作者简介