砷对鲇鱼毒作用机理和抗砷相关基因克隆及功能分析

摘要

首次在黄河上游发现了黄河兰州鲇鱼的新分布群体。为了进一步查清兰州鲇鱼和其它鲇鱼的形态区别和生物学特性，以便于加大对濒危物种保护，促进繁衍力度，进行了兰州鲇鱼的形态学，骨骼解剖学和发育生物学研究，并首次繁育我国特产优质兰州鲇鱼的苗种成功，使濒危兰州鲇的保护增殖和开发利用成为了现实。 本论文进行了砷对鲇鱼的毒作用机理研究。砷对鲇鱼的生物化学影响研究结果表明，砷能使鲇鱼脑、鳃、肝和骨骼肌肉中G-6-PDH和LDH活性显著降低，说明在As(Ⅲ)胁迫下磷酸戊糖途径的效率降低，减少了磷酸戊糖途径产生的NADPH；LDH活性的降低是砷胁迫可能改变了酶的构象，两种酶活性的下降造成鲇鱼组织损伤。被As(Ⅲ)染毒的鲇鱼脑、鳃、肝和骨骼肌RNA逐渐降低，表明As(Ⅲ)可能抑制RNA合成；其蛋白质含量逐渐减少，说明砷抑制了鲇鱼核酸的转录和蛋白表达。撤离As(Ⅲ)染毒源后，鲇鱼脑、腮、肝、骨骼肌的G-6-PDH和LDH活性、RNA和蛋白质含量能逐步恢复到对照水平，逆转了As(Ⅲ)对鲇鱼的代谢酶、RNA和蛋白质的影响，但是鲇鱼体内具有砷残留。 通过研究As(Ⅲ)在鲇鱼组织的累积与毒作用特征表明，鱼可能具有比人类更强的抗砷能力。经高、中、低浓度的As(Ⅲ)染毒鲇鱼，测定鲇鱼重要组织砷的累积量，表明鲇鱼的腮和骨骼肌组织As(Ⅲ)富集量较高；肝脏中As(Ⅲ)累积量明显低于其它组织，表现出对砷的抗性。 在小于0.1mg/LNaAsO2的水体中，鲇鱼骨髂肌组织没有在显微镜下观察到组织损伤，且砷的累积量小于0.05mg/kg(国家食品标准是0.05mg/kg)，说明小于0.1mg/LNaAsO2的水体对鱼和人类是安全的。在大于0.5mg/LNaAsO2的水体中，鲇鱼骨骼肌中砷累积量可大于0.05mg/kg，而且显微镜观察到组织有损伤，说明大于0.5mg/LNaAsO2的水体对鱼可造成危害，肌肉中的砷富集可超过0.05mg/kg，可能对人体造成危害。 通过研究砷对鲇鱼毒作用的组织病理变化发现，在大于0.5mg/LNaAsO2水体中鲇鱼脑、肝脏、鳃、骨骼肌具有不同程度的损伤，这种损伤具有浓度依赖性。小于0.1mg/LNaAsO2的水体对鲇鱼组织没有损伤，对环境和人具有安全。 本论文首次克隆了As(Ⅲ)诱导下鲇鱼抗砷相关基因以及对其进行了功能分析。从鲇鱼提取RNA，分离获得mRNA，构建鲇鱼cDNA文库，进行菌斑原位杂交，克隆出鲇鱼3个新基因，分别命名为：SiRAS、SiATA、SiSERCA2。SiRAS核苷酸2718bp，编码一个由906个氨基酸组成的蛋白质。SiATA核茁酸为1024bp，编码一个由341个氨基酸组成的蛋白质。SiSERCA2核苷酸有2971bp，编码一个由990个氨基酸组成的Ca2+泵-Ca2+-ATPase，是调节细胞内Ca2+浓度的重要蛋白质之一。 SiRAS、SiATA分别与砷胁迫中具有重要作用的ars2、ArsA的相似性比较高，ArsA编码膜相关的ATP酶结合砷泵排出As(Ⅲ)。SiSERCA2与质膜上的Ca2+泵-SERCA2相似性比较高。Northern杂交分析表明，SiRAS和SidTA在鲇鱼肾、肝脏、脑、心脏、鳃、骨骼肌中都表达，只是SiRAS和SiATAmRNA在不同组织中累积量不同；其在肾中转录水平高，脑、肝脏、鳃转录水平低于肾，在心脏SiATAmRNA累积量低，在骨骼肌肉中SiATA转录水平最低。SiSERCA2仅在心肌和骨骼肌表达，在肾组织中不表达。同时SiRAS、SiATA、SiSERCA2的表达被砷诱导，SiRAS、SiATAmRNA积累的速度比较快，SiSERCA2mRNA累积的速度比较慢。Sorthern杂交分析表明，SiRAS、SiATA、SiSERCA2分别在鲇鱼基因组中是单拷贝数。另外，SiRAS、SiATA、SiSERCA2都能在原核生物中高效表达，它们编码的蛋白表现出了明显的转录激活能力。这些结果表明SiRAS、SiATA、SiSERCA2参与砷胁迫的信号转导途径。 对鲇鱼抗砷相关基因的研究将有助于系统、全面的了解生物抗砷的调控网络，以阐明它们的抗性机理，在基础理论或应用方面都有重要意义。真核生物抗砷基因的研究刚刚起步，鲇鱼基因的研究无疑具有理论意义和实际参考价值，这也将为评价砷对人体健康、环境的危害、培育抗砷鱼类优良品种提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章 兰州鲇生物学研究

第三章 砷对鲇鱼的毒作用机理研究

第四章 鲇鱼SiRAS基因的克隆以及功能分析

第五章 鲇鱼SiATA基因的克隆以及功能分析

第六章 鲇鱼SiSERCA2基因的克隆以及功能分析

第七章 结论

参考文献

致谢

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