拟南芥TOUSLED基因在维持转录基因沉默中的功能分析

摘要

转录水平的基因沉默是由于外源基因整合到植物基因组中造成的转基因或同源的内源基冈沉默的现象。这种现象通常是与DNA甲基化和组蛋白修饰有关。这一过程中有很多与DNA甲基化和组蛋白修饰有关的蛋白参与。拟南芥中的ROS1基因编码一个DNA糖基化酶(glycosylase/lyase)，参与DNA去甲基化过程。ROS1基因发生突变后能够使多拷贝的转基因LUC和内源RD29A基因沉默，这是由于外源和内源RD29A启动子甲基化升高造成的。同时T-DNA上与LUC相邻的Pro<,35S>;NPTⅡ也被沉默，从而使转基因植物的卡那霉素抗性丢失。35S启动子DNA基本没有甲基化，NPTⅡ基因的沉默是由于35S启动子区域组蛋白修饰变化引起的，在这个区域中H3K9二甲基化升高，H3K4二甲基化降低。 我们把对卡那霉素敏感的rosl突变体经过EMS诱变，从后代中挑选出一些能够恢复卡那抗性的突变体。其中两个表型一样的等位突变体是TOUSLED(TSL)基因突变造成的。TSL是一个在动物和植物中保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，最早在拟南芥中被克隆，它对于植物叶子和花的正常发育非常重要。TSL基因发生突变后，NPTⅡ基因表达，tslrol双突变体能够在50mg/L的卡那培养基上正常生长，但对于LUC和内源RD29A基因的表达没有影响。根据亚硫酸氢盐测序和Southern blot结果显示，TSL基因突变并没有改变转基因和内源RD29A启动子的甲基化水平，对于着丝粒区，rDNA区域以及Ta3区域等DNA甲基化水平很高的区域也没有影响，而在重新活化的35S启动子区域，转基冈C24，rosl突变体和tslros突变体中都没有甲基化。这说明TSL影响基冈表达并不是在DNA甲基化水平上发生的。除了NPTⅡ基因，TSL突变后还能部分激活内源TSI域的转录，但是对其它转座子区域的表达没有影响。染色质免疫共沉淀(ChIP)表明，在tslrosl双突变体中，35S启动子和TSI区域组蛋白H3K9二甲基化水平比rosl突变体降低，在35S区域H3K4的二甲基化水平有所升高，这说明这两个区域基因沉默的释放是由于组蛋白修饰发生了变化，而不是由DNA甲基化变化引起的。但是Westernblot结果显示，H3K9和H3K4二甲基化的整体水平没有改变。这说明TSL基因突变对组蛋白修饰的影响可能仅限于某些特定区域。以前体外研究结果证明组蛋白H3可能是TSL的底物之一，但是根据ChIP和Western结果显示TSL可能不负责H3Ser10的磷酸化。哺乳动物中的TSL同源蛋白TLK与DNA损伤修复有关，用UV-B和MMS处理5天的苗显示，tslrosl双突变体表现出比转基因C24和rosl突变体更明显的敏感性。这说明拟南芥中的TSL可能也与DNA修复有关。虽然ROS1和TSL都可能参与DNA修复，但是酵母双杂交结果表明二者没有互作，因此它们的功能可能有相对独立性。我们的证据显示，TOUSLED可能是以一种不依赖于DNA甲基化的方式，在维持拟南芥基因组某些区域的转录基因沉默中起作用。

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论文说明：缩略词表

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第一章文献综述

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌种及质粒载体

2.1.3酶和试剂

2.1.4植物培养材料

2.1.5实验主要仪器

2.2实验方法

2.2.1突变体筛选及遗传分析

2.2.2基因定位

2.2.3 TSL基因的克隆

2.2.4突变体基因表达特征的分析

2.2.5突变体DNA甲基化特征分析

2.2.6突变体组蛋白修饰分析

2.2.7 UV及MMS处理

2.2.8 TSL蛋白与ROS1及ROR1蛋白互作分析

2.2.9 microRNA和siRNA检测

第三章实验结果与分析

3.1 tslros1突变体的获得及遗传分析

3.2 TSL基因的克隆

3.3 tsl/ros1突变体对基因表达的影响

3.4 TSL突变对DNA甲基化的影响

3.4.1 TSL突变对内源和外源RD29A启动子甲基化的影响

3.4.2 TSL突变对35S启动子和TSIs区域甲基化的影响

3.4.3 TSL突变对整个基因组DNA甲基化的影响

3.5 TSL突变对组蛋白修饰的影响

3.6 TSL突变对DNA损伤修复的影响

3.7 TSL与ROS1的关系

第四章讨论与结论

参考文献

致 谢

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