植物乳杆菌的分离鉴定及其作为食品级基因工程受体菌的特性研究

摘要

由于乳酸菌的益生作用，乳酸菌分子生物学及作用机制成为近年来学术界的研究热点。乳酸菌中的乳杆菌属自身的免疫原性和优良的胃肠道定植能力使得其作为食品级基因工程受体菌的应用前景十分广阔。鉴于乳杆菌属中的植物乳杆菌(LactobacilIus plantarum)在食晶、饲料和医疗行业的巨大商业价值，本研究旨在从食品原料中分离鉴定获得植物乳杆菌，并从中筛选到一株有望成为食品级基因工程受体菌的菌株，同时鉴定该受体菌的抗突变活性，以期筛选出一株自身具有抗突变活性并且能够成为食品级基因工程受体菌的优良菌株。 本研究从韩国泡菜中分离纯化出五株菌Lact1、Lact2、Lact3、Lact4和Lact5，经形态学、生化、生理鉴定和16S rDNA全序列分析鉴定，将测序结果在GenBank上进行Blast比对，构建系统发育树，鉴定出五株菌均与植物乳杆菌的亲缘关系最近。选择没有天然质粒存在且是nisin敏感的菌株作为食品级基因工程受体菌的候选菌株，使用带有nisI基因作为nisin免疫选择标记的食品级克隆载体pLEB590对其进行转化，优化电转化条件，得出使用含有终浓度为6％甘氨酸的MRS制备感受态细胞，2kV电压下，最高可得到8.204x10<'3>转化子/μg质粒DNA。携带载体pLEB590的菌株可以耐受最大为550 IU/ml的nisin浓度，并且在nisin选择压力下能够保持外源质粒的遗传稳定性。利用SOS显色反应鉴定出Lact2对基因毒素4-NQO具有抗突变活性，且抗突变率约64％。 本课题初步筛选到一株自身具有抗突变活性并且有潜力成为基因工程受体菌的植物乳杆菌，为利用nisin免疫作为筛选标记的食品级表达体系的构建奠定了基础。

目录

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论文说明：缩略词表

声明

第一章绪论

1.1乳酸菌食品级基因工程菌的研究进展

1.1.1乳酸菌的定义和分类

1.1.2食品级基因工程菌

1.1.3乳酸菌食品级基因表达系统研究进展

1.1.4乳酸菌食品级基因工程受体菌的研究进展

1.2植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的研究进展

1.2.1植物乳杆菌的生理功能研究

1.2.2植物乳杆菌在食品中的应用

1.2.3植物乳杆菌作为基因工程受体菌的研究进展

1.3乳酸菌电转化的研究进展

1.4乳酸菌的抗突变活性

1.4.1抗突变活性

1.4.2乳酸菌的抗突变机理

1.4.3乳酸菌抗突变活性物质的组成分析

1.4.4植物乳杆菌KLAB的抗突变活性

1.4.5使用SOS色反应鉴定乳酸菌的抗突变活性

1.5本研究的目的和技术路线

1.5.1目的意义

1.5.2技术路线

第二章泡菜中植物乳杆菌的分离纯化和鉴定

前言

2.1材料与试剂

2.1.1泡菜来源

2.1.2菌株与质粒

2.1.3 培养基

2.1.4试剂及其配制

2.1.5主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1乳酸菌的分离筛选

2.2.2乳酸菌的生理生化鉴定

2.2.3 16S rDNA全长序列分析鉴定

2.3结果与分析

2.3.1乳酸菌的分离筛选结果

2.3.2乳酸菌的生理生化鉴定结果

2.3.3 16S rDNA全长序列分析鉴定结果

2.4讨论

第三章植物乳杆菌食品级基因工程受体菌的筛选

前言

3.1材料与试剂

3.1.1菌株与质粒

3.1.2试剂及培养基

3.1.3试剂的配制

3.1.4主要仪器设备

3.2试验方法

3.2.1乳杆菌质粒提取

3.2.2受体菌nisin敏感浓度测定

3.2.3乳球菌质粒提取

3.2.4质粒载体纯度和浓度的测定

3.2.5植物乳杆菌电转化步骤

3.2.6 Lact2感受态细胞制备时甘氨酸浓度的确定

3.2.7 Lact2菌株电转化时电压的确定

3.3结果与分析

3.3.1菌株天然隐蔽质粒的检测

3.3.2菌株的nisin敏感浓度测定

3.3.3载体pLEB590的制备

3.3.3 pLEB590的纯度和浓度检测

3.3.4 Lact2感受态细胞制备时甘氨酸浓度的确定

3.3.5 Lact2电转化时电压的确定

3.3.6 Lact2/pLEB590基因工程菌的鉴定

3.3.7 Lact2/pLEB590基因工程菌的nisin敏感浓度测定

3.3.8 Lact2中pLEB590的遗传稳定性分析

3.3.9使用相同电转化条件转化其它菌株

3.4讨论

第四章植物乳杆菌的抗突变活性鉴定

前言

4.1材料与试剂

4.1.1菌株

4.1.2培养基

4.1.3试剂配制

4.1.4主要仪器设备

4.2试验方法

4.2.1指示菌Escherichia coli PQ37的验证

4.2.2指示菌Escherichia coli PQ37的保藏

4.2.3 SOS色反应标准程序

4.2.4乳酸菌对4-NQO抗突变活性的测定

4.3结果与分析

4.3.1指示菌Escherichia coli PQ37的验证

4.3.2 SOS显色反应标准程序

4.3.3 Lact2对4-NQO抗突变活性鉴定

4.4讨论

第五章结论

5.1小结

5.2展望

参考文献

致谢

个人简历