苹果DELLA相关基因的克隆及功能初步鉴定

摘要

柱型苹果作为苹果生产中的丰产树型之一，是苹果高度密植栽培的理想品种。决定柱型苹果遗传特性的柱型基因Co与调控树型发育的重要内源激素——赤霉素(GA)之间的关系是苹果柱型突变分子机制研究的热点问题。 本试验以柱型苹果“威赛克”及非柱型苹果“旭”为试材，利用苹果DELLA相关基因的序列信息设计了特异引物，通过PCR扩增克隆目的基因。将目的基因插入至pCAMBIA1305．1植物表达载体中，农杆菌EHA105介导的叶盘法转化本生烟，并通过PCR、RT-PCR以及GUS染色法检测转基因植株；将目的基因插入至GFP瞬时表达载体pEZ-NL，中，通过基因枪法，转入洋葱表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察目的基因蛋白的亚细胞定位。试验结果如下： 1．从苹果“威赛克”和“旭”中克隆了2个与DELLA相关的基因——MdRGL1a、MdRGL2a，长度分别为1920bp、1743bp。经DNAMAN软件分析，威赛克、旭的MdRGL1a，威赛克、旭的MdRGL2a核苷酸序列同源性为100％;所推测的氨基酸序列均含有．DEllA蛋白家族所特有的结构区域。初步表明这两个基因在苹果不同品种间高度同源，与苹果威赛克的柱型突变无关。 2．构建了植物表达载体pRGL1a-GUS、pRGL2a-GUS，MdRGL1a、MdRGL2a转基因植株分别经潮霉素筛选，以及PCR、RT-PCR检测、GUS染色验证．MdRGL1a、MdRGL2a基因成功转入烟草植株中。 3．构建得到GFP瞬时表达载体pRGL1a-GFP、pRGL2a-GFP，荧光定位初步确定MdRGL1a和MdRGL2a蛋白主要定位在细胞核上。

目录

文摘

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声明

第一章前言

1.DELLA蛋白家族研究进展

1.1 DELLA蛋白家族

1.2 DELLA信号转导模型

2.果树矮化相关基因的研究进展

2.1 Dw基因

2.2 Co基因

2.3 MdRGL基因

2.4 Vvgai基因

3.研究意义

第二章目的基因的克隆

1.材料与方法

1.1材料

1.2 DNA提取

1.3威赛克和旭MdRGL1a、MdRGL2a的克隆

2.结果与分析

2.1 DNA提取及质量检测

2.2 MdRGL1a、MdRGL2a序列分析

3.讨论

第三章表达载体构建及转基因烟草获取

1.材料与方法

1.1材料

1.2表达载体pRGL1a-GUS、pRGL2a-GUS的构建

1.3农杆菌介导法转化本生烟及转基因植株再生

2.结果与分析

2.1 RGL1a-GUS、RGL2a-GUS的克隆及表达载体pRGL1a-GUS、pRGL2a-GUS的构建

2.2烟草遗传转化和转基因植株的获得

3.讨论

第四章转基因烟草检测

1.材料与方法

1.1材料

1.2 PCR检测

1.3 RT-PCR检测

1.4 GUS检测

2.结果与分析

2.1 PCR检测

2.2 RT-PCR检测

2.3 GUS检测

3.讨论

第五章MdRGL1a、MdRGL2a基因蛋白亚细胞定位

1.材料与方法

1.1材料

1.2瞬时表达载体pRGL1a-GFP、pRGL2a-GFP的构建

1.3基因枪法转化基因到洋葱表皮细胞

2.结果与分析

2.1 RGL1a-GFP、RGL2a-GFP的克隆及瞬时表达载体pRGL1a-GFP、pRGL2a-GFP的构建

2.2 RGL1a-GFP、RGL2a-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞的亚细胞定位结果

3.讨论

第六章小结

参考文献

致谢

个人简历