苹果MdFT基因克隆及功能的初步鉴定

摘要

果树花芽形成是产量形成的基础，而大多数果树在第一次开花结果之前常常需要经历一个漫长的营养生长期——童期。童期的存在严重阻碍了杂交育种的进程，延长了育种周期。基因工程技术的发展为解决这一难题提供了新途径。最近，FT蛋白已被证明是植物中的“成花素”，苹果MdFT基因是拟南芥AtFT基因的同源基因，本研究开展了该基因的克隆和功能鉴定工作，取得的结果有： 1、通过RT-PCR扩增，从苹果栽培品种‘嘎拉’叶片cDNA中克隆了MdFT基因，同时，从拟南芥生态型Columbia中克隆了AtFT基因作为对照。序列分析表明，在氨基酸水平上，MdFT与AtFT的同源性为72．6%。 2、聚类分析表明，推导的MdFT蛋白与来自拟南芥、水稻、柑桔、杨树等的FT同源基因推导的蛋白同归于FT类。 3、构建了植物表达载体35S：：MdFT和35S：：AtFT。利用根癌农杆菌介导法，将它们导入拟南芥生态型Columbia和番茄栽培品种‘中蔬一号’中，得到了抗卡那霉素的阳性转化植株。经PCR扩增检测，证明它们已经导入转化的拟南芥基因组；经PCR扩增和半定量RT-PCR检测，证明它们已经导入转化的番茄基因组，并在转录水平得到了表达。 4、转基因拟南芥的Quantitative RT-PCR检测表明，MdFT基因通过调节下游成花相关基因的表达诱导拟南芥产生早花现象。 5、亚细胞定位结果显示，MdFT-GFP蛋白主要定位在细胞膜上。 6、形态鉴定结果表明，无论是转基因拟南芥植株还是番茄植株，均表现出早花性状。在短日照条件下，转35：：MdFT拟南芥植株在8．9片莲座叶期即开始抽薹开花，而野生型植株通常要在莲座叶长到60片以后才开始抽薹开花。在温室栽培条件下，5株35S：：MdFT转基因番茄植株的花芽分别为第4、8、11、7和9节位形成，而非转基因再生对照植株均在第11节位以上形成花芽。

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第一章文献综述

1高等植物成花发育概述

1.1成花诱导的相关理论

1.2成花相关基因的调控

2控制植物花发育的基因种类

2.1成花计时基因

2.2分生组织特性基因

2.3定域基因

2.4调控花器官形成的基因

3苹果基因组研究的困难与遗传转化研究现状

第二章苹果MdFT基因的克隆及其功能的初步鉴定

1材料

1.1植物材料

1.2菌株和质粒

1.3化学试剂和工具酶类

1.4引物合成与测序

1.5培养基

2试验方法

2.1试验流程

2.2核酸的提取

2.3 RNA的检测

3目的基因的扩增

3.1 cDNA链的合成

3.2 PCR扩增MdFT和AtFT基因

3.3 PCR扩增产物的回收

4回收产物的克隆

5质粒DNA的提取

6植物表达载体的构建、转化及鉴定

6.1表达载体构建方法

6.2表达载体构建的操作步骤

7拟南芥的转化和筛选

7.1渗透法转化拟南芥

7.2转化子的筛选

8叶盘法转化番茄

9 MdFT蛋白的亚细胞定位

9.1 MdFT-GFP融合蛋白表达载体的构建

9.2洋葱表皮细胞的浸染和转化

9.3 MdFT蛋白的亚细胞定位观察

3结果与分析

3.1目的基因的克隆

3.2 MdFT的序列分析

3.3 MdFT蛋白的聚类分析

3.4植物表达载体的构建

3.5转基因拟南芥的获得和鉴定

3.6转基因番茄的PCR检测和半定量RT-PCR分析

3.7转基因番茄出现早花

3.8 MdFT基因通过调节下游开花相关基因诱导拟南芥开花

3.9 MdFT基因的组织特异性表达检测

3.10 MdFT蛋白的亚细胞定位

4讨论和结论

4.1高等植物各成花调控途径之间存在着共同的整合因子

4.2内源基因和转化材料的选择

4.3“开花素”的物质本质已经被证明

4.4苹果成花相关基因的分离及其特征的初步研究

4.5鉴定MdFT基因功能的下一步研究方向

致 谢

参考文献

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