鸭细菌人工染色体文库的构建及连锁群的FISH定位

摘要

鸭可作为活化石用于对鸟类进化的研究，和鸡一样有着很多的优势，可作为模式动物对重要数量性状和疾病进行研究。鸭结构基因组学是功能基因组和鸟类比较基因组研究的基础，为了能够更多的了解鸭的基因组结构，本实验主要通过构建鸭细菌人工染色体文库，然后应用BAC-FISH技术对连锁群进行物理定位。 抽取一只北京母鸭静脉血，用于制备大分子量基因组DNA。制备好的基因组经过HindHI部分酶切后，二次脉冲电泳分离片段。电洗脱回收200kb～500kb范围的片段，然后与plndigo-5BAC载体连接，转化DHl0B感受态细胞，经过培养，挑取和保存白色的单克隆。 文库共有84,480个单克隆(保存在22个超级池，每个超级池由10个384孔板组成)。随机挑选了234个克隆进行插入片段大小的估计，平均为117.94kb，其中空克隆的比例为1．28％，表明文库的覆盖率为9.84倍。同时，用位于不同染色体上的14个微卫星标记和8个功能基因进行文库PCR筛选，所有这些标记和基因都得到了阳性克隆，克隆数从2到20不等，平均为9．82。说明文库具有良好的覆盖率，并且与前面鉴定结果一致。从文库中筛选任意目的DNA序列的概率为99.99％。 为了把鸭遗传图谱和物理图谱结合起来，本实验通过选择位于6条不同连锁群上的8个微卫星标记AMU56，AMU60，AMU68，AMU173，CAUD027，CAUD052，CAUD065，CAUD088，对已构建好的鸭子BAC文库进行筛选，得到的阳性克隆作为探针，应用．FISH手段分别将其定位到不同的鸭子中期染色体分裂相上。 微卫星标记CAUD027被FISH定位到鸭l号染色体上。根据连锁群CAU1上已定位的别的标记，就可对1号连锁群CAU1在染色体上进行排列定向。另外，根据国际上鸡的标准G带核型图，将该标记具体定位到了1号染色体短臂1p21-23区域。 连锁群CAU2上的标~ECAtUD065被FISH定位到了鸭2号染色体短臂区2p22-24，同样也可用于对CAU2在染色体上进行定向。 位于连锁群CAU19上的两个标记AMU60，AMU173则被定位到了鸭5号染色体5q17处，该连锁群是首次被定位。由于该连锁群只有两个标记构成，因此要对该区域/染色体进行更进一步深入和准确的研究，最大的可能就是要筛选得到越来越多的微卫星标记，提高连锁群的标记密度。 本研究所用的其它标记，CAU9连锁群上的AMt168和CAUD088，CAU10上的AMU56，CAU4上的CAUD052均被定位到了鸭小染色体上。目前，国际上尚没有区分禽类小染色体的标准，因此无法区分它们在几号染色体，尽管AMU68和CAUD088位于同一条连锁群上。 BAC-FISH的结合在染色体分析中发挥了很多的优势。然而，鸭基因图谱的密度还非常有限，相信很快会有越来越多的分子标记和鸭功能基因被定位，并且会在功能基因组水平上进行分析研究。此外，随着鸭高密度物理图谱的构建以及比较基因组学的分析，将会对鸟类基因组进化机制有更深入的了解。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分文献综述

第二部分鸭BAC文库构建与鉴定

1材料

1.1主要药品和酶

1.2主要仪器

1.3常规试剂

2.鸭BAC文库构建

2.1实验动物

2.2菌株和克隆载体

2.3试剂

2.4实验方法

3 BAC文库的保存与鉴定

3.1主要试剂：

3.2主要仪器：

3.3 Pooling总技术路线

3.4实验步骤

4.实验结果

4.1文库构建

4.2文库的管理和PCR筛选系统的构建

4.3文库的鉴定和分析

5.分析与讨论

5.1克隆载体的制备

5.2高分子量DNA的制备

5.3大片段的选择

5.4大片段的回收

5.5连接转化

5.6 BAC克隆大小的鉴定

5.7 PCR筛选文库的可行性

第三部分荧光原位杂交

1鸭胚胎成纤维细胞的培养

1.1实验动物

1.2主要仪器及部分耗材

1.3主要溶液及其配制

1.4实验操作步骤

2染色体标本制备及核型分析

2.1实验对象

2.2主要仪器及部分耗材

2.3主要溶液及其配制

2.4实验步骤

3探针的制备

3.1 BAC文库筛选

3.2BAC DNA的提取(同第二部分3.4.4.1)与纯化

3.3探针标记

3.4粉碎基因组DAN的制备

4荧光原位杂交及检测

4.1主要仪器及部分耗化

4.2主要溶液及其配制

4.3实验方法

5实验结果

5.1鸭胚胎成纤维细胞培养

5.2鸭成纤维细胞核型

5.3鸭BAC文库筛选

5.4探针标记

5.5FISH定位结果

6分析与讨论

6.1关于FISH

6.2定位结果分析

第四部分 结论

参考文献

致谢

附录

个人简历