蜡样芽孢杆菌超氧化物歧化酶生理功能研究及与细菌定殖相关性分析

摘要

蜡样芽孢杆菌905(Bacillus cereus 905)是在小麦体内分离获得的一株有益芽孢杆菌，温室和田间应用结果显示，该细菌在小麦、水稻等很多作物上都表现出促生和防病效果，能在小麦根围稳定定殖。为深入研究该细菌定殖的分子基础，本研究选择从氧自由基毒性这一个角度，针对超氧化物歧化酶(SOD)这一氧自由基消除的关键酶在细菌中的生理功能及定殖小麦过程中的相关性进行分析探讨。 首先，利用功能互补的方法进行B．cereus 905 SOD基因的克隆。外源的SOD可以恢复SOD基因缺失大肠杆菌Escherichia coli QC779对过量自由基的抗性。构建该细菌的基因组粘粒文库，转染E．coli QC779，得到了两个不同的克隆表现出SOD活性。SOD化学抑制法鉴定和序列分析发现它们都是MnSOD，异源表达验证了DNA编码蛋白的SOD功能。比较这两个MnSOD序列(sodA-1和sodA-2)，发现这两个MnSOD的序列的同源性很低，只有58.43％。他们与其它细菌来源的MnSOD的同源性也低于50％。分析它们可能独立进化的。 按双交换的突变方法，从工具载体pEBS的构建、突变思路的完善到转化参数的优化，建立了适用于芽孢杆菌的基因缺失体系。在该体系的基础上，构建了SOD突变菌株B．cereusKO1(△sodA-1)、B．cereus KO2(△sodA-2)和B．cereus KOS(AsodA-1 AsodA-2)。突变体SOD活性和组分的检测结果发现，这两种不同SOD占据细菌胞内的绝大部分SOD活性，MnSOD2在不同的处理下的活性都比MnSOD1的活性高出一倍多。过量的氧自由基不能明显诱导这两个基因的转录和表达。 最后，通过分析比较突变体菌株与原始菌株的生理变化和定殖能力，分析了MnSOD1和MnSOD2在细菌生理中的功能及与定殖的相关性。结果显示，较MnSOD1相比，MnSOD2在细菌应对各种环境，包括氧自由基胁迫、低营养等条件下，表现更为重要的功能。这种结果同样反映在细菌定殖小麦根围的比较结果中。结果表明MnSOD在细菌定殖过程发挥着不可缺失的作用。

目录

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论文说明：缩略词

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第一章绪论

1.1文献综述

1.2研究意义

1.3研究内容

第二章Bacillus cereus 905 SOD基因的克隆及表达

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.2.1 B.cereus 905菌株的基因组文库的构建

2.2.2粘库的筛选

2.2.3 905菌株中超氧化物歧化酶基因分析

2.2.4蜡样芽孢杆菌905的MnSOD基因在大肠杆菌中的表达

2.2.5蜡样芽孢杆菌905的Cu/ZnSOD基因的克隆及表达

2.3本章小结

第三章B.cereus 905基因缺失体系的构建

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.2.1芽孢杆菌基因缺失工具载体的构建

3.2.2 sodC缺失载体的构建

3.2.3 sodC缺失菌株B.cereus KOC的构建

3.3本章小结

第四章Bacillus cereus 905 MnSOD基因缺失菌株的构建及细菌SOD酶活分析

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.2.1蜡样芽孢杆菌sodA-1缺失菌株的构建

4.2.2蜡样芽孢杆菌sodA-2缺失菌株的构建

4.2.3蜡样芽孢杆菌sodA-1 sodA-2双缺失菌株的构建

4.2.4蜡样芽孢杆菌体内SOD活性分析

4.2.5蜡样芽孢杆菌sodA-1和sodA-2表达差异性分析

4.3本章小结

第五章B.cereus 905 SOD生理功能及与细菌根围定殖相关性分析

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.2.1 SOD突变体对氧自由基的敏感性测定

5.2.2 SOD突变体产生的营养缺陷分析

5.2.3 SOD突变体在小麦根围定殖动态及定殖能力分析

5.2.4 sodC突变体B.cereus KOC生理性状分析及定殖能力分析

5.3本章小结

第六章结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

6.3进一步研究设想

参考文献

附录

致谢

作者简介