组蛋白修饰在猪卵母细胞成熟过程中的变化及其与减数分裂恢复的关系

摘要

含有数量和类型众多的可修饰残基是组蛋白尾部一个显著特征。大量研究证实组蛋白修饰与有丝分裂细胞中染色质整体环境的建立、DNA复制、修复及转录、核小体组装、染色质浓缩以及染色体分离等生物学事件密切相关。但是，目前对于组蛋白修饰在哺乳动物卵母细胞中的分布方式和基本功能的研究还很少而且仍然存在争议。本研究旨在通过应用共聚焦扫描、免疫印记及其它一些分子生物学手段分析猪卵母细胞成熟过程中组蛋白甲基化和磷酸化的亚细胞分布方式，并进一步探讨它们在减数分裂中的潜在功能。这些研究结果将有助于进一步充实和完善哺乳动物卵母细胞的成熟机制。 首先，通过应用免疫荧光和免疫印记两种方法，本实验详细研究了猪卵母细胞成熟过程中组蛋白H3丝氨酸10和28(H3/ser10、H3/set28)磷酸化的时空分布与表达情况。结果显示，H3/ser1O、H3/set28的亚细胞分布方式大不相同，在生发泡期(GV)，H3/serl0的磷酸化水平偏低。随着卵母细胞由GV期向GV晚期(L-GV)过渡时的逐渐去磷酸化，染色体外周的H3/ser1O在生发泡破裂早期(E-GVBD)发生了短暂的再磷酸化。之后，从第一次减数分裂前中期(Pre-MⅠ)到第二次减数分裂中期(MⅡ)荧光信号迅速增强并分布于整个染色体。与之相似，在猪卵母细胞从GV到E-GVBD阶段，H3/ser28只发生了低水平磷酸化，这一结果提示组蛋白H3的去磷酸化可能参与了猪卵母细胞减数分裂恢复的调节。此外，我们还观察到Pre-MI、MⅠ以及MⅡ期卵母细胞内高水平的H3/ser28磷酸化分布于染色体外周。 接着，通过应用激光共聚焦扫描显微技术，又对组蛋白H3赖氨酸4和9(H3/K4、H3/K9)甲基化在猪卵母细胞成熟过程中的亚细胞分布作了细致检测。结果显示，它们在GV期发生了甲基化，并与染色质完全共定位。随着染色质的进一步浓缩，H3/K4和H3/K9逐渐去甲基化。在L-GV期，卵母细胞内浓缩染色质上的组蛋白H3发生了去甲基化，但是生发泡内分散的染色质依然被甲基化。在E-GVBD期，浓缩的染色质团上的H3/K4和H3/K9出现了完全的去甲基化。不过，当猪卵母细胞发育到Pre-MⅠ时，组蛋白又重新发生甲基化，而且这种甲基化状态一直持续到MⅡ期。猪卵母细胞成熟过程中，染色质结构和功能发生剧烈变化，且转录活动始终处于沉默状态。上述研究结果显示，在猪卵母细胞成熟过程中，所有被研究的氨基酸残基均出现了一致的去修饰变化(包括组蛋白甲基化、磷酸化和乙酰化)。因此，进一步应用共聚焦扫描和mRNA差异显示两种方法初步探讨了组蛋白修饰对减数分裂恢复过程中相关事件的可能影响。数据表明，TSA(一种组蛋白去乙酰化酶的抑制剂)抑制了GV到GVBD阶段的组蛋白去乙酰化，并显著干扰了猪卵母细胞减数分裂恢复过程中染色质的正常浓缩，促使高比例的猪卵母细胞阻滞在GV-Ⅲ期。此外，TSA处理猪卵母细胞也可能活化了一些原本处于抑制状态的基因的转录。总之，本研究结果表明猪卵母细胞GVBD前后组蛋白发生了去甲基化、去磷酸化和去乙酰化，而这些过程很可能是卵母细胞减数分裂恢复必需的。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章卵母细胞成熟及组蛋白修饰研究进展

1.1卵母细胞成熟概述

1.2组蛋白研究概述

1.3组蛋白修饰研究进展

第二章筛选差别表达基因的主要方法

2.1 mRNA差异显示技术

2.2抑制性消减杂交技术

2.3基因表达系列分析技术

2.4基因芯片技术

第三章组蛋白磷酸化在猪卵母细胞成熟过程中的变化

3.1材料和方法

3.2实验结果

3.3讨论

小结

第四章组蛋白甲基化在猪卵母细胞成熟过程中的变化

4.1材料和方法

4.2实验结果

4.3讨论

小结

第五章组蛋白修饰对减数分裂恢复过程中染色质状态和转录活动影响的初步研究

5.1材料与方法

5.2实验结果

5.3讨论

小结

第六章结论

参考文献

致 谢

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