骨痹止痛液对兔膝骨性关节炎软骨中TGF-β、IGF-1mRNA表达及组织形态学的影响

摘要

目的：本课题通过RT-PCR检铡膝关节软骨组织T G F-P、IGF-1基因表达水平、骨组织形态学变化的影响；免疫组化法检铡TGF-P蛋白表达水平的变化来证实骨痹止痛液确切的效果，探讨骨痹止痛液防治膝骨性关节炎的作用机制，为临床应用骨痹止痛液治疗膝骨性关节炎提供理论依据。
　　方法：将72只6~8月龄、体童2.5~3kg,雌雄不限的新西兰大白兔按计算机随机数字分为6组，分别为低剂量骨痹止痛液组、中剂量骨痹止痛液组、高剂量骨痹止痛液组、盐酸氨基葡萄糖组、模型组，每组各12只。参考改良Hulth法建立骨性关节炎模型，分别给5组造模白兔灌喂低、中、高骨痛止痛液，盐酸氨基葡萄糖片，生理盐水，并于第4周、第8周处死各组兔取样，切取关节软骨标本，肉眼观察形态学改变和光镜观察H E染色的病理切片。釆取RT-PCR检铡兔膝关节软骨中T G F-P、IGF-1因子的表达；釆用免疫组化法检测TGF-P蛋白表达水平。所得数据釆用SPSS19.0软件进行统计分析。
　　结果：
　　1.肉眼观察：正常膝关节应表面光滑，色泽透明，无增生。4周后模型组关节软骨色泽暗淡无光泽，关节表面不光滑，部分成米黄色，无明显缺损，滑膜增厚。骨痹止痛液组及盐酸氨基葡萄糖片组软骨透明度较模型组髙，无缺损及骨赘新生物。8周后模型组关节软骨变黄，软骨层面出现不同程度的缺损，软骨透明度明显降低，有明显骨赘形成，软骨甚至出现糜烂。而骨痹止痛液组及盐酸氨基葡萄糖片组较前无明显变化。
　　2.H E染色镜下观察：正常软骨表面由于未受损伤，所以比较平整。在显微镜的观察下，软骨表面分布有均匀的微孔，微孔通过肉哏看不到，只能在显微镜下才能看到微小的微孔；软骨表面还存在礙胶样的物质’呈白色、球状，并以点状分布于软骨表面；4周模型组软骨组织在HE染色镜下观察：结果发现软骨表面的表层细胞变薄，并呈现粗糙的表面；甚至部分软骨表面的软骨组织的消失，呈绒毛状；严重的部分软骨表层脱失，表面出现龟裂样的裂隙，软骨深层的胶原纤维被暴露出来。
　　正常软骨细胞结构清楚，细胞膜完整，轮廓请晰，核内染色质分布均匀，胞外可见纵橫交锴的胶原纤维，模型组细胞膜榕解，密度分布不均一，存在细胞簇集现象，软骨细胞排列紊乱，潮线多不完整；骨痹止痛液高、中、低剂量组和盐酸氨基葡萄糖片组软骨组织损伤情况好于糢型组，软骨细胞排列不规则现象在部分区域仍可见，但相比模型组明显少见，各层界限欠清楚，镜下个别区域有族集现象，潮线个别不完整。8周模型组表现可见软骨结构破坏，骨赘形成。各治疗组较前无明显差异。
　　3.RT-PCR检铡TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA：骨痹止痛液低剂量组与模型组第8周比较，骨痹止痛液低剂量组第8周大白兔软骨标本中TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA表达量明显升高，骨痹止痛液中、高剂量组及盐酸氨基葡萄糖片组第8周大白兔软骨标本中TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA表达量显著升高;与骨痛止痛液低剂量组第8周比较，骨痹止痛液中、高剂量组及盐酸氨基葡萄糖片组第8周大白兔软骨标本中TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA表达量明显升高;与盐酸氨基葡萄糖片组第8周比较，骨痹止痛液中、高剂量组第8周大白兔软骨标本中T G F-P irKNA、IGF-1 mRNA表达量无明显差异；与第4周骨痹止痛液低、中、高剂量组及盐酸氨基葡萄糖片组比较，第8周骨痛止痛液低、中、高剂量组及盐酸氨基葡萄糖片组大白兔软骨标本中TGF-P irRNA、IGF-1 irRNA表达量明显升高。
　　4.免疫组化法检铡T G F-P蛋白：与空白组比较，模型组软骨组织TGF-1P蛋白表达7K平显著降低，组间差异具有统计学意义,与模型组比较，骨痹止痛液高、中、低剂量可升高软骨组织TGF-1P蛋白表达水平，且以骨痹止痛液高剂量和盐酸氨基酸葡萄糖作用显著。
　　结论：本实验通过H E染色观察组织学改变来评估组织学损伤指数（HI)，结果显示模型组关节软骨表面粗糙，凹凸不平，局部出现龟裂样改变，严童者表层脱失，说明模型组关节软骨层发生变化，证明造模成功；同时PCR检铡不同剂量的骨痹止痛液对兔膝骨性关节炎不同时期的软骨细胞中TGF-P、IGF-1因子表达，各治疗组关节软骨因子T G F-P、IGF-1表达较模型组显著升高，说明骨痹止痛液对实验性兔膝骨性关节炎具有治疗作用，长期服用可以抑制关节软骨的退变。盐酸氨基葡萄糖片同样表现出对细胞因子（TGF-自、I G F-1)的促进作用，且与骨痹止痛液高中剂量组在数据统计上显示无差异性，而且骨痹止痛液髙、中、低剂量可升髙软骨组织TGF-1P蛋白表达水平，可以认为骨痹止痛液在膝骨性关节炎的防治上有相对优势有必要进一步开展基础及临床上的运用。骨痹止痛液能够促进软骨细胞中的T G F-P、IGF-1等因子的表达，进一步证实骨痹止痛液的临床疗效。

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符 号 说 明

前言

一 、立题依据

1.OA的现代医学研究现状

2.OA的中医学研究现状

3.本实验的研究目的及意义

二 、 实 验 研 究

1.实验技术路线图

2.实验材料

3 实验方法

4 实验结果

三 、 讨 论

1.中西医关于骨关节炎的认识及诊疗

2.骨痹止痛液的药物组方分析

3.基于TGF-P、IGF-1探讨骨痹止痛液防治O A 的作用机制

四 、 结 语

1.结论

2.问题与展望

参考文献

附录1 各组4周后肉眼观察软骨组织大体标本

附录2 4周后各组软骨组织HE染色镜下观察

附录3 动物造模及工作场景

附录4

文 献 综 述

1.流行病学

2.发病原因及发病机制

3.治疗研究进展

4.总结

参考文献

致谢

在学期间主要研究成果