用Real Time PCR和DGGE技术研究放牧藏系绵羊瘤胃微生物季节动态

摘要

藏系绵羊主要分布于西藏、青海、甘肃和四川等高寒地区，是具有特殊遗传特性的动物，是当地牧民生活的物质基础和经济来源。与其它反刍动物一样，藏羊在进化过程中获得的前胃发酵功能也非常完善和高效。与其它反刍动物不同的是，藏羊所生存环境的更加恶劣，饲料来源更加困难，饲料的营养成分也更加贫乏，但环境胁迫使其对饲料的利用更为高效，瘤胃的发酵功能更为完善，为它的生存提供了重要保障。研究瘤胃微生物的目的，是为了了解它们的形态、生理、繁殖、地理分布、种群相互作用及与宿主之间的相互依赖关系，为合理利用饲草、饲料资源提供依据。本论文对不同季节青藏高原放牧藏系绵羊瘤胃细菌、真菌、甲烷菌和琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)的数量动态变化进行了研究，并分别对不同季节藏系绵羊瘤胃细菌和古细菌区系的动态进行了研究。共进行了以下四个试验： 试验一：采用模拟采食，结合尼龙袋法的方法，测定了试验羊放牧地(青海三角城种羊场)冬春季、夏季和秋季各牧场的牧草营养成分、放牧采食量和消失率。结果表明：牧草营养成分(混合草样)随季节变化，其中粗蛋白质、能量含量均为夏季＞秋季＞冬春季；中性洗涤纤维，酸性洗涤纤维含量为夏季＜秋季＜冬春季。春、夏、秋和冬季牧草干物质的消失率分别为：48.81±8.25﹪、52.07±1.03﹪、51.43±3.05﹪、50.28±1.23﹪。春、夏、秋和冬季绵羊CP、ME食入量为：2.63±0.01g/kgw0.75·d、0.41±0.00MJ/kgW0.75·d,12.80±0.08g/kgW0.75·d、1.33±0.01MJ/kgW0.75·d,6.39±0.03g/kgW0.75·d、0.57±0.002MJ/kgW0.75·d,4.05±0.01g/kgW0.75·d、0.39±0.003MJ/kgW0.75·d。 试验二：以青藏高原环青海湖地区藏系绵羊瘤胃内容物为样品，以获取尽可能全面代表瘤胄微生物种类、不被其它来源DNA污染的可用于分子生物学研究的总DNA为目的，采用改进后的液氮反复冻融+CTAB法提取微生物总DNA。提取瘤胃微生物总DNA长度在23Kb以上，OD260/OD280均在1.59-1.68。用细菌和古细菌的16SrDNA通用引物和特异引物，从纯化前后瘤胃微生物总DNA中成功扩增出目标条带，表明该法能充分破碎包括细菌、真菌在内的各种瘤胃微生物细胞壁。 试验三：以青藏高原环青海湖地区藏系绵羊瘤胃内容物样品总DNA，研究不同季节藏系绵羊瘤胃微生物的季节变化。采用RealTimePCR技术，利用国际原子能机构提供的细菌、真菌、产甲烷菌和琥珀酸丝状杆菌的引物，在建立了瘤胃微生物绝对定量与相对定量的分子生物学方法基础上，研究不同季节藏系绵羊瘤胃细菌、真菌、产甲烷菌、琥珀酸丝状杆菌的动态变化。结果表明：①夏季由于动物采食大量营养丰富的牧草，因而其瘤胃内细菌数量明显高于其它三个季节，分别是春季、冬季和秋季的5.56，2.35、2.49倍；秋季和冬季瘤胃细菌数量变化却不明显。②夏季瘤胃内产甲烷菌数量明显高于其它三个季节，分别比冬季、秋季和春季增加353.15﹪、334.69﹪、545.31﹪：秋季和冬季瘤胃产甲烷菌数量变化却不明显(仅比冬季低4﹪)。③瘤胃真菌在秋、冬、春、夏季，真菌在瘤胃内相对约为细菌的0.14﹪，0.11，0.19﹪和0.03﹪。瘤胃真菌秋季比冬、夏季增加了19.34﹪、79.55﹪，夏、冬季比春季降低了84.92﹪、68.18﹪，夏季比冬季降低了74.65﹪，春季比秋季高出35.66﹪。④春季瘤胄琥珀酸丝状杆菌数量低于其它三季，春季比夏季、秋季和冬季降低了20.58﹪、54.31﹪、58.53﹪。冬季比夏季、秋季增加了50.00﹪、10.19﹪，秋季比夏季增加了44.90﹪。 试验四：以青海放牧藏系绵羯羊瘤胃内容物微生物总DNA为模板，用有GC夹的引物经聚合酶链式反应(PCR)扩增细菌DNA的16SrDNA的V6-V8区和古细菌DNA的16SrDNA的V2-V4，扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE，一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌及古细菌区系的季节变化。结果表明：①瘤胃细菌区系在秋、冬季相似性低于60﹪，而在春季和夏季相似性大于90﹪；秋季瘤胃细菌多样性指数值(Shannon-Wiener指数)为1.42±0.07，显著(p＜0.05)高于其它三季节，冬、春、夏多样性指数值分别为1.27±0.08、1.29±0.03、1.28±0.04，三者之间差异不显著(p＞0.05)。②秋季、冬季、春季和夏季瘤胃古细菌区系相似性高于90﹪：冬、春、夏、秋季节瘤胃古细菌多样性指数值分别为1.39±0.02、1.33±0.098、1.25±0.05、1.19±0.03；瘤胄古细菌种多样性，冬季与春季差异不显著(p＞0.05)，但显著高于夏季(p＜0.05)，极显著高于秋季(p＜0.01)，而春季与夏季差异不显著(p＞0.05)，显著高于秋季(p＜0.05)；夏、秋季差异不显著(p＞0.05)。 本试验结果显示，不同放牧季节，藏系绵羊采食养分含量不同的牧草，不但影响着瘤胃微生物的数量，而且也影响着微生物多样性。夏季微生物数量高于其它季节，秋季微生物多样性高于其它季节，瘤胃细菌区系在秋季比其它季节复杂，古细菌区系在冬春季节比夏秋季节多样性高。

目录

文摘

英文文摘

前言

致 谢

第一篇文献综述

第二篇试验研究

第一章放牧地牧草营养分成的季节变化

第二章藏系绵羊瘤胃微生物总DNA的提取

第三章用Real time-PCR技术研究藏系绵羊瘤胃微生物季节变化

第四章变性梯度凝胶电泳法研究藏系绵羊瘤胃微生物季节变化

第五章总结论

第六章论文创新点及需进一步研究的问题

主要参考文献

个人简介及在学期间发表的文章

导师简介

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