三七总皂苷对K562细胞抗肿瘤作用及机制的研究

摘要

目的：
　　(1)研究三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)对体外培养K562细胞增殖、凋亡、周期及相关信号蛋白表达的影响。
　　(2)研究三七总皂苷体外作用K562细胞后对mTOR信号通路活性的影响。
　　(3)研究三七总皂苷联合柔红霉素对体外培养K562细胞增殖的影响。
　　方法：
　　(1)体外培养K562细胞，绘制其生长曲线。不同浓度的PNS(0～800μg/mL)干预对数生长期的K562细胞24h、48h及72h后，MTT比色法检测PNS作用后K562细胞的增殖变化； PNS(100μg/mL，200μg/mL及400μg/mL)干预对数生长期的K562细胞后，AO/EB双荧光染色后使用荧光显微镜观察对照组及加药组细胞死亡及凋亡的形态变化；Annexin V-FITC/PI双染色后使用流式细胞仪检测对照组及加药组细胞的凋亡率；PI单染后使用流式细胞仪检测对照组及加药组细胞周期的变化；蛋白印迹检测对照组及加药组细胞cleaved caspase-3、cyclin D1、Fas蛋白表达量的变化。
　　(2) PNS(100μg/mL，200μg/mL及400μg/mL)干预对数生长期的K562细72h后，使用RT-PCR法检测mTOR、p70S6K以及4E-BP1的mRNA表达情况；蛋白印迹法检测mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p70S6K、p-p70S6K(Thr229/389)、4E-BP1、p-4E-BP1(Thr37/46)的蛋白表达量。
　　(3)柔红霉素(DNR)(0～1.0μg/mL)单独作用对数生长期的K562细胞24h、48h及72h后，MTT比色法检测DNR对K562细胞增殖的抑制作用。PNS联合低浓度DNR作用于体外培养K562细胞48h时间后，MTT法检测细胞的增殖变化，AO/EB双荧光染色后使用荧光显微镜观察对照组及实验组细胞死亡及凋亡的形态变化。
　　结果：
　　(1)在浓度为100～800μg/mL时，PNS对 K562细胞有增殖抑制作用(P<0.05)，并呈现作用时间及药物浓度依赖性，当作用时间为72h，PNS的IC50为(229.07±2.36)μg/mL。与对照组相比，100～400μg/mL PNS作用于K562细胞48h后，细胞凋亡率增加(P<0.05)，并且G0/G1期细胞增多(P<0.05)，而G2、S期细胞减少(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白表达上调(P<0.05)，cyclin D1蛋白表达下降(P<0.05)，Fas蛋白表达无明显变化。
　　(2)与对照组相比，100～400μg/mL PNS作用于K562细胞72h后，mTOR mRNA表达量降低(P<0.05)，mTOR蛋白表达下降(P<0.05)，p70S6K及4E-BP1蛋白表达无明显变化，磷酸化蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-p70S6K(Thr229/389)和 p-4E-BP1(Thr37/46)的表达量下降(P<0.05)。
　　(3) DNR(0.0625～1.0μg/mL)能够明显抑制K562细胞的增殖。PNS与DNR联合作用后能提高其对K562细胞的增殖抑制率。
　　结论：
　　(1) PNS能够抑制K562细胞增殖，促进K562细胞凋亡，上调cleaved caspase3蛋白表达，并使其发生周期阻滞，下调cyclin D1蛋白表达。
　　(2) PNS使K562细胞mTOR信号通路活性降低，mTOR蛋白表达下调，mTOR、p70S6K和4E-BP1蛋白的磷酸化水平下调。
　　(3) PNS增强柔红霉素对K562细胞的抑制作用。

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封面

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中文摘要

英文摘要

引言

材料和仪器

一、实验材料

二、实验仪器

实验方法

1 三七总皂苷对K562细胞增殖、凋亡及周期的影响

2 PNS对K562细胞mTOR信号通路活性的影响

3 PNS联合抗癌药DNR对K562细胞的影响

4 统计分析

实验结果

1 PNS抑制K562细胞增殖

2 PNS抑制 K562细胞mTOR信号通路的活性

3 PNS联合DNR抑制 K562细胞增殖活性

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A：英 文 缩 略 词 表

附录B：个人简历

附录C综述：肿瘤mTOR信号通路的研究进展