两种猪源病毒基因图谱绘制及分子免疫研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)和猪2型圆环病毒(Porcinecircovirustype2，PCV2)病是当今养猪业严重关切的两种重大传染病之一，两病的广泛流行和蔓延已给世界各国养猪业的发展造成了严重威胁和经济损失。在现代化规模养猪场中，PCV2与PRRSV往往混合感染，发病率呈上升趋势。为了有效控制这两种传染病的流行，减少由此引起的经济损失，本研究以PCV2和PRRSV当地流行毒株为研究材料，进行了基因克隆、分子结构特征分析、基因图谱绘制、分子诊断、流行病学调查及免疫研究，主要研究成果如下： (1)应用RT-PCR技术，分段克隆了PRRSVGS株基因，采用DNAStar软件将各基因依次拼接，并对其特征进行了分析，绘制了PRRSVGS株全基因图谱和系统进化树。结果表明，该毒株全基因组长15427bp，包含8个阅读框(ORF)，其中5’端非编码区长190bp，与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性分别为56.3﹪～97.9﹪；ORF1长11882，其中0RF1a长7512bp，与国内外参考毒株核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为54.3﹪～98.7﹪和49﹪～99.3﹪，ORF1b长4374bp，与国内外参考毒株核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为60.8﹪～95.5﹪和49﹪～99.3﹪；结构蛋白基因长约3819bp，分为6个结构蛋白基因区，与BJ-4、CH-1a、HB-2(sh)/2002和VR-2332美洲株等核苷酸的同源性分别为：ORF293.1﹪～96.6﹪，ORF390.7﹪～96.5﹪，ORF488.1﹪～95.5﹪，ORF587.9﹪～95.0﹪，ORF695.1﹪～97.1﹪，ORF792.2﹪～95.7﹪，推导的氨基酸同源性分别为：ORF291.1﹪～95.7﹪，ORF389.4﹪～92.5﹪，ORF488.3﹪～96.6﹪，ORF587.1﹪～95.0﹪，ORF696﹪～97.1﹪，ORF790.3﹪～95.2﹪；3’端非编码区长151bp，与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性分别为70.9﹪～100﹪；最后有一个长14个碱基的poly(A)尾。从系统进化树分析，PRRSVGS株同以LV株为代表的欧洲型遗传距离较远，而与以VR-2332株为代表的北美洲型和流行于我国的毒株遗传距离较近，进一步证实了流行于我国的毒株在基因型上属于北美洲型。 (2)构建了PRRSVGS株E基因的重组腺病毒质粒，转染AD-293细胞，经荧光检测表明获得了AD-E复制缺陷型腺病毒。用重组腺病毒AD-E免疫小鼠，以间接ELISA和MTT法检测小鼠血清抗体水平和T淋巴细胞增殖情况，结果能刺激T淋巴细胞增殖，但未能检测到小鼠血清中的抗体，其原因有待进一步研究。 (3)应用PCR技术对从甘肃猪场分离的3株PCV2毒株进行了全序列测定，其中PCV2Ww株基因组长度为1768bp，PCV2LZ和TS株长1767bp，将序列登陆到Genbank获得3个登录号DQ322701、DQ363860和DQ355153，绘制了PCV2基因图谱和系统进化树。3株之间的全基因组核苷酸同源性为96.4﹪～99.4﹪，而主要阅读框ORF1的核苷酸及氨基酸之间的同源性分别为99.2﹪～99.8﹪和99.0﹪～99.4﹪，说明ORF1非常保守，这与其编码蛋白的功能有关；而阅读框ORF2的核苷酸及氨基酸之间的同源性分别为92.6﹪～99﹪和92.7﹪～98.7﹪，变异相对于ORF1较大；3株之中LZ株和Ww株之间同源性较高，而与TS株相对较远。从系统进化树上分析，目前我国分离的毒株比较复杂，有的来源于欧洲，有的来源于北美洲，本研究分离的3株皆属于欧洲型。另外，本研究还建立了PCV2的PCR检测方法，应用该方法对甘肃部分猪场PCV2的发病情况进行了调查，结果感染率为74.1﹪，证明甘肃猪场普遍存在有PCV2感染。 (4)构建了PCV2Ww株Cap基因与猪α-IFN基因的真核表达载体pIRES-Cap-α-IFN，用该质粒免疫小鼠，以间接ELISA和MTT法检测小鼠血清抗体水平和T淋巴细胞增殖情况，结果pIRES-Cap-α-IFN免疫组能刺激T淋巴细胞增殖，促进机体产生体液免疫。 (5)构建了PCV2Ww株Cap基因的重组腺病毒质粒，转染AD-293细胞，经荧光检测获得了AD-Cap复制缺陷型腺病毒。用重组腺病毒AD-Cap免疫小鼠，以间接ELISA和MTT法检测小鼠血清抗体水平和T淋巴细胞增殖情况，结果能刺激T淋巴细胞增殖，促进机体产生体液免疫。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

第一章绪言

第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒基因克隆、结构特征分析及基因图谱绘制

一、猪繁殖与呼吸综合征病毒5’端非编码区的分子克隆及序列分析

二、猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白基因的克隆及结构特征分析

三、猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因克隆及结构特征分析

四、猪繁殖与呼吸综合征病毒3’端非编码区的分子克隆及序列分析

第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因腺病毒载体的构建及分子免疫研究

第四章三株猪2型圆环病毒流行毒株基因克隆、结构特征分析及基因图谱绘制

第五章猪2型圆环病毒核酸载体构建及分子免疫研究

第六章猪2型圆环病毒Cap基因的腺病毒载体构建及分子免疫研究

第七章结论

文献综述一猪圆环病毒研究进展

文献综述二猪繁殖与呼吸综合征研究进展

参考文献

致谢

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