PBI121-Lyz-GFP基因表达载体的构建及其对紫花苜蓿愈伤组织的转化

摘要

以紫花苜蓿不同品种(“甘农3号”、和田苜蓿、秘鲁苜蓿)为研究对象，进行了抗病基因对紫花苜蓿的转化的研究。筛选出了愈伤组织诱导的最佳培养基及其激素组合；构建了GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)和Lyz(lysozyme，溶菌酶)基因的表达载体PBI121-Lyz-GFP；优化了农杆菌介导的苜蓿基因转化体系；并将抗病基因Lyz基因和报告基因GFP导入和田苜蓿中。对转化的愈伤组织进行了分子检测及荧光检测，证实了Lyz基因和GFP已整合到苜蓿基因组中并得到表达。主要研究成果如下： 1、运用正交试验设计，建立苜蓿下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基。结果表明：对于秘鲁苜蓿和甘农3号苜蓿，最适愈伤组织诱导的培养基均为MS+2,4-D(2.0mg/L)+,6-BA(0.5mg/L)+NAA(1.0mg/L)，各因素影响程度皆为6-BA>NAA>KT。对于和田苜蓿，最适愈伤组织诱导的培养基为MS+2,4-D(2.0mg/L)+6-BA(1.0mg/L)+KT(1.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)，各因素影响程度为6-BA>KT>NAA。 2、构建了GFP和Lyz基因的植物表达载体PBI121-Lyz-GFP。将GFP基因插入到质粒载体PBI121-Lyz中，构建了含有卡那霉素抗性选择标记的植物表达载体PBI121-Lyz-GFP，并通过液氨冻融法将其导入农杆菌LBA4404。 3、遗传转化体系的建立。以培养7天的和田苜蓿的无菌苗下胚轴为外植体，以农杆菌菌株为介体，优化的基因转化体系如下：Kan筛选浓度定为40～50 mg/L；抑菌剂选取Carb为宜，愈伤诱导阶段浓度为200 mg/L；用于转化的侵染时间为10min；外植体预培养时间为3 d；与农杆菌共培养3 d。经筛选，得到69块具有卡那霉素抗性的愈伤组织，经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化到和田苜蓿愈伤组织中。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：主要英文缩略词表

声明

第一章文献综述

1苜蓿组织培养研究进展

1.1基本培养基的选择

1.2外植体的选择

1.3激素配比

1.4紫花苜蓿再生体系建立存在的问题

2植物抗病基因工程研究进展

2.1植物抗真菌基因工程

2.2植物抗细菌病基因工程

2.3植物抗病基因工程的前景展望及存在问题

3溶菌酶的研究进展

3.1溶菌酶的理化性质

3.2溶菌酶的分布

3.3溶菌酶的结构

3.4溶菌酶的种类及作用

3.5溶菌酶的抗菌谱

3.6溶菌酶的应用

4绿色荧光蛋白(GFP)研究进展

4.1 GFP基础理论研究进展

4.2 GFP的结构、生化特性、发光机制、光谱特性

4.3 GFP的改进

4.4 GFP的应用

4.5问题及展望

第二章不同苜蓿品种愈伤组织诱导培养基的优化

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1不同培养基对秘鲁苜蓿愈伤组织诱导的影响

2.2不同培养基对甘农3号苜蓿愈伤组织诱导的影响

2.3不同培养基对和田苜蓿愈伤组织诱导的影响

3讨论

3.1优化培养基的意义

3.2激素对愈伤组织诱导的影响

3.3利用正交设计法筛选最适愈伤组织诱导培养基

4小结

第三章植物表达载体PBI121-Lyz-GFP的构建

1实验材料和方法

1.1实验材料

1.2基本培养基

1.3溶液配制

2引物设计和技术路线

2.1引物的设计

2.2植物表达载体的构建策略

2.3 PBI121-Lyz-GFP构建的基本技术路线

3实验方法

3.1小量碱裂解法提取质粒

3.2 PCR扩增

3.3 PCR产物回收

3.4 GFP基因PCP产物与PUCm-T载体的连接与转化

3.5 PUCm-T-GFP和PBI121-Lyz的酶切及纯化

3.6 PUCm-T-GFP与PBI121-Lyz酶切产物的连接与转化

3.7重组质粒PBI121-Lyz-GFP的PCR和酶切检测

3.8植物表达载体向农杆菌的转化

4结果与分析

4.1克隆目的基因

4.2植物表达载体PBI121-Lyz-GFP的构建及检测

4.3植物表达载体PBI121-Lyz-GFP转化根癌农杆菌

5讨论

5.1关于植物表达载体PBI121-Lyz-GFP构建策略的讨论

5.2关于对农杆菌的转化及其鉴定

第四章农杆菌介导的PBI121-Lyz-GFP基因对紫花苜蓿的转化研究

1材料和方法

1.1材料

1.2试验方法

1.3转基因愈伤组织的鉴定

2结果与分析

2.1卡那霉素浓度对和田苜蓿种子萌发的影响

2.2筛选培养中卡那霉素选择压的确定

2.3筛选培养中抗生素种类及其浓度的确定

2.4转化体系的建立

2.5和田苜蓿转化愈伤组织的鉴定

3讨论

3.1农杆菌菌株对转化的影响

3.2抗生素对愈伤组织诱导的影响

3.3关于绿色荧光蛋白的检测

3.4后续研究工作展望

4小结

参考文献

致谢

附图

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