牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析

摘要

以甘南牦牛、天祝白牦牛和青海高原牦牛3个群体为研究对象，采用PCR-SSCP技术对牦牛生长激素（GH）基因5个外显子及部分内含子序列进行遗传变异分析，旨在获取相应的分子遗传学信息，明确牦牛GH基因的遗传特性，为牦牛重要性状的分子标记和改良提供依据。研究结果如下：3个牦牛群体GH基因的GH-P1、GH-P2和GH-P4的扩增产物通过PCR-SSCP检测分析，均未发现多态性。GH-P3扩增片段在第3内含子1694bp处发生T→C转化，形成A、B两个等位基因，检测到AA、AB、BB3种基因型。等位基因A（B）在甘南牦牛、天祝白牦牛和青海高原牦牛的基因频率分别为：0.8342（0.1658）、0.9028（0.0972）和0.8958（0.1042），等位基因A为三个群体中的优势等位基因。GH-P5扩增片段有C、D两个等位基因，检测到CC和CD2种基因型。其中，甘南牦牛GH基因第5外显子2154bp处发现A→G单碱基突变，导致由甘氨酸（Gly）变为丝氨酸（Ser）；天祝白牦牛第5外显子2373bp处发现G→T单碱基突变，但未引起氨基酸变化，为沉默突变；青海高原牦牛在此位点未发现多态性。等位基因C（D）在甘南牦牛、天祝白牦牛群体的基因频率分别为：0.9158（0.0842）、0.916（0.084）。等位基因C为群体中的优势等位基因。通过多态信息含量（PIC）统计，GH-P3和GH-P5扩增区域产生的SNPs位点均处于低度多态（PIC<0.25）。进行了Hardy-Weinberg平衡检验，第3内含子3个牦牛群体均处于非平衡状态，第5外显子甘南牦牛和天祝白牦牛处于平衡状态。

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引言

第一部分文献综述

1生长激素(GH)简介

1.1 GH的结构特点

1.2 GH信号转导途径

1.3 GH的主要生物学功能

2 GH基因研究进展

2.1 GH基因的定位

2.2 GH基因的结构

2.3 GH基因的表达与调控

2.4 GH基因的研究进展

3分子标记在牦牛育种中的应用及意义

3.1牦牛分子育种的基础研究

3.2分子遗传标记在牦牛上的研究领域

3.3分子标记在牦牛育种中的应用

3.4 PCR-SSCP分子标记方法

4研究的目的与意义

第二部分GH基因多态性检测及序列分析

1.材料和方法

1.1试验材料

1.2主要试剂

1.3主要仪器设备

1.4分析工具软件

1.5溶液试剂配制

2主要试验步骤

2.1牦牛冻存血样DNA提取

2.2 PCR扩增

2.3 SSCP凝胶电泳

2.4 GH基因部分序列的克隆和测序

3.统计方法

3.1基因型频率

3.2基因频率

3.3基因位点Hardy-Weinberg平衡状态的检验

3.4群体内遗传变异的度量指标-杂合度

3.5有效等位基因数

3.6多态信息含量

第三部分结果与分析

1牦牛基因组DNA样品的检测

2 PCR-SSCP多态性检测结果

2.1 GH基因外显子1及部分内含子的PCR-SSCP多态性检测结果

2.2 GH基因外显子2及部分内含子的PCR-SSCP多态性检测结果

2.3 GH基因外显子3及部分内含子的PCR-SSCP多态性检测结果

2.4 GH基因外显子4及部分内含子的PCR-SSCP多态性检测结果

2.5 GH基因外显子5及部分内含子的PCR-SSCP多态性检测结果

3克隆与序列分析

3.1 GH-P3测序对比结果

3.2 GH-P5测序对比结果

4 GH基因多态位点群体遗传学分析

4.1基因频率和基因型频率在不同牦牛群体中的分布

4.2 GH基因第3内含子和第5外显子遗传多样性分析

4.3 GH基因GH-P3和GH-P5的Hardy-Weinberg平衡检验

第四部分讨论

1样品采集和DNA提取方法

1.1采样

1.2 DNA提取方法

2 PCR扩增的主要影响因素

2.1模板DNA的质量和用量

2.2引物

2.3退火温度(Tm)和镁离子浓度(Mg2+)的确定

2.4 TaqDNA聚合酶的选择和用量

3 PCR-SSCP技术影响因素分析

4牦牛GH基因遗传特性的分析

4.1 GH基因第3内含子多态性

4.2 GH基因第5外显子多态性

4.3甘南牦牛、天祝白牦牛及青海高原牦牛GH基因遗传多样性分析

第五部分结论

致谢

参考文献

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附录