FMDV受体猪源整联蛋白αvβ6单克隆抗体制备及分布的研究

摘要

口蹄疫（food-and-mouth disease，FMD）是一种由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物急性高度接触性传染病。FMDV属于小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属病毒，有7个血清型，分别称为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亚洲Ⅰ型（Asia1）。FMDV感染细胞的先决条件是首先与细胞膜表面的受体结合，研究表明至少有5种细胞识别机制，即细胞表面的整联蛋白avβ1、avβ3、avβ6、avβ8和硫酸乙酰肝素可作为FMDV的受体。 本试验将含有口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域基因的重组质粒B612p，转化到BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG诱导表达后制备β6亚基配体结合域基因目的蛋白，并将其作为抗原免疫BALB/c小鼠，经过4次免疫后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，利用SDS-PAGE电泳、间接ELISA法、Western blot分析及间接免疫荧光法等方法对制备的单克隆抗体的特异性进行鉴定。成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株，分别命名为：C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B786，其分泌的McAb为IgG2b（C2D8）和IgG2a（4C7、E7C7、B8C9、B786）亚类。在此基础上利用单克隆抗体检测整联蛋白avβ6受体在组织中的表达分布。 利用pcDNA3．1（+）-β6p真核表达载体稳定转染CHOK1细胞，间接免疫荧光法检测整联蛋白β6亚基在转染细胞中的表达分布。间接免疫组化法和间接免疫荧光法检测整联蛋白avβ6在健康猪舌、唇、气管等组织中的表达分布，抗猪源整联蛋白B6亚基配体结合域的单克隆抗体作为一抗，FITC标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG分别作为二抗。结果表明，pcDNA3．1（+）-β6p真核表达载体稳定转染的CHOK1细胞的细胞膜及细胞质内可见致密的绿色荧光，猪舌、唇、气管等组织细胞的细胞膜及细胞质内均出现了特异阳性反应物，表明整联蛋白avβ6受体广泛分布于猪体的器官组织细胞中，为深入研究整联蛋白avβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略表

声明

第一章 前言

第二章 文献综述

1口蹄疫病毒受体结合位点

2整联蛋白的结构与功能

3整联蛋白avβ1

4整联蛋白avβ3

5整联蛋白avβ6

6整联蛋白avβ8

7硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)受体

8其他细胞受体

9病毒受体的研究方法

9.1电镜技术

9.2受体基因的克隆及表达

9.3单克隆抗体法

9.4病毒覆盖蛋白结合试验

9.5噬菌体展示技术

9.6 DNA重组技术

9.7酵母双杂交系统

10展望

第三章 FMDV受体猪源整联蛋白avβ6单克隆抗体的制备及鉴定

1材料

1.1抗原、细胞株、动物

1.2培养基

1.3主要试剂

1.4主要仪器设备

2方法

2.1抗原制备

2.2动物免疫，筛选方法的建立及小鼠效价测定

2.3杂交瘤细胞株的建立

2.4杂交瘤细胞的扩大培养及冻存

2.5单克隆抗体的大量制备

2.6单克隆抗体的纯化

2.7单克隆抗体的鉴定

3结果

3.1抗原制备

3.2间接ELISA法抗原最佳包被浓度的确定

3.3全部免疫BALB/c小鼠抗体效价检测

3.4单克隆抗体的筛选及杂交瘤细胞株的建立

3.5单克隆抗体纯化

3.6单克隆抗体的亚类鉴定及杂交瘤细胞上清、腹水效价

3.7杂交瘤细胞染色体的鉴定

3.8单克隆抗体的稳定性鉴定

3.9单克隆抗体的特异性鉴定

3.10单克隆抗体抗原结合表位的分析

3.11单克隆抗体饱和值测定

3.12单克隆抗体相对亲和力常数的测定

4讨论

4.1抗原的制备

4.2动物免疫

4.3细胞融合

4.4杂交瘤细胞株的筛选

4.5单克隆抗体的鉴定

4.6腹水的制备

4.7单克隆抗体的纯化

4.8单克隆抗体的抗原结合表位分析、饱和值及亲利力常数的测定

第四章 FMDV受体猪源整联蛋白avβ6的细胞定位及组织分布

1材料

1.1动物组织

1.2克隆载体

1.3主要试剂

1.4主要仪器设备

2方法

2.1 B6亚基在转染细胞中的表达分布

2.2冰冻组织切片制备

2.3间接免疫组化法检测整联蛋白avβ6的表达分布

2.4免疫荧光法检测整联蛋白avβ6的表达分布

3结果

3.1 β6亚基在转染细胞中的表达

3.2间接免疫组化法检测整联蛋白avβ6的表达分布

3.3间接免疫荧光法检测整联蛋白avβ6的表达分布

3.4整联蛋白avβ6的组织表达分布优势

4讨论

4.1冰冻组织切片制备

4.2间接免疫组化法检测整联蛋白avβ6的表达分布

4.3间接免疫荧光法检测整联蛋白avβ6的表达分布

第五章 研究结论

参考文献

附录 溶液的配制

致谢

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