浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究

摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）草质优良、营养丰富、适口性强，被誉为“饲草之王”，是亚洲、北美洲利用最广泛、最重要的豆科牧草。然而，反刍牲畜采食新鲜苜蓿后易引起臌胀病（bloat），影响到它在放牧方面的利用。一般认为，苜蓿叶片中浓缩单宁（condensed tannins，CT）含量低是引起反刍牲畜臌胀病的主要原因。通过遗传调控，促使叶片中CT合成和积累是苜蓿遗传育种的重要研究内容，具有重要的理论和实践意义。
　　 CT的生物合成是通过莽草酸途径产生的苯丙氨酸经一系列反应最终形成，由众多酶参与。二氢黄酮还原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）是其生物合成途径中的关键酶，调控DFR基因的表达水平可以改变CT的积累，但转基因紫花苜蓿中dfr的表达水平有待进一步提高。PNZIP（pharbitis nilleuzipper）启动子具有使基因在光合组织中高效表达，而在非光合组织中表达水平很低的组织特异性启动子。为了提高紫花苜蓿叶片以及茎等家畜采食器官中CT含量、获得抗臌胀病紫花苜蓿的种质新材料，本实验开展了DFR基因和PNZIP组织特异启动子的克隆、PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体构建及对紫花苜蓿遗传转化研究，取得了如下结果：
　　 1.以蒺藜苜蓿（Medicargo trunctula L.）幼果为试材，采用RT-PCR方法克隆到二氢黄酮还原酶（DFR）基因cDNA片段。该片段全长1018 bp，编码337个氨基酸，与GenBank中已注册的DFR基因同源性为99.8％。构建DFR基因原核表达载体pETDFR，DFR在原核表达系统中得到了高效表达，获得预期大小（39.8 kDa）的酶蛋白分子，说明克隆的DFR基因编码序列完整。
　　 2.采用PCR技术，从裂叶牵牛（pharbitis nil choisy Morninga Glory）基因组DNA中克隆到1487 bp的PNZIP启动子。序列分析表明：该片段除含有一个典型的真核生物核心启动子区域（-60～-10 bp）和多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件外，还存在I-box、ACE、G-box、CAANNNNATC元件、Box-Ⅱ、CCAAT-盒等6类光效应元件，预示着在光合组织的生物代谢中具有调控作用。以绿色荧光蛋白基因（GFP）作为报道基因，构建PNZIP启动子驱动的GFP基因植物表达载体，在转GFP基因烟草的绿色组织，尤其是叶肉、茎中都得到高效表达，说明表明所克隆的PNZIP启动子具有光合组织表达的特异性。
　　 3.以pBI121为基础载体，分别构建了组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR。用含有pBIDFR、pPNDFR的农杆菌（EHA105）工程菌转化烟草（Nictiana tabacum L.）品种红花大金子（2n=4X=48），分别获得了27株和23株Kan抗性植株。采用正丁醇盐酸法测定了野生烟草（对照）、不同启动子驱动的DFR基因转化再生烟草的叶片、茎和根等器官中的CT含量，结果表明以组成型启动子驱动的DFR基因（pBIDFR）转化烟草各器官中CT含量显著高于对照，叶片中的含量达到4.27
　　 mg/g，比对照叶片中的CT含量高75％；而以光合组织特异表达启动子驱动的DFR基因（pPNDFR）转基因烟草的茎叶中CT含量显著高于野生型烟草，其中叶片中浓缩单宁含量达到4.01 mg/g，比对照叶片的含量高64.34％。说明PNZIP启动子的活性接近组成型启动子CaMV35S，但从能量角度考虑，PNZIP启动子驱动基因的表达模式更为经济。
　　 4.以苜蓿优良品种“中苜一号”为材料，研究了农杆菌工程菌pPNDFR/EAH105的转化体系，得出以5～7d龄子叶预培养3 d、采用OD6000.3的工程菌液侵染30 min.和共培养3 d的转化体系，抗性愈伤组织诱导率高达70％。获取的抗性愈伤组织经过诱导，最终获得了6株抗性转基因植株和一批抗性不定芽。