锯缘青蟹性别分化和性腺发育的EST及基因芯片初步分析

摘要

本研究采用SMART技术结合DSN处理，成功地构建了线性化cDNA文库三个，其中精巢和卵巢文库各一个，另一个为精巢、卵巢、眼柄、输精管、射精管和产雄腺混合的文库。经测定三个文库的滴度分别为4.8×105 cfu/mL，3.1×106 cfu/mL，5.3×106 cfu/mL，所有三个文库扩增后都含有1011以上重组子。各文库的插入cDNA长度均分布在0.5-3kb，经随机PCR检测，初步确定了三个文库重组率分别为93.7％、95.8％和100％。
　　 随机从文库中挑取6816个克隆(其中688个来自精巢文库，926个来自卵巢文库，5202个来自混合文库)进行EST(Expressed Sequence Taq)测序，共得到6116条ESTs，其中测长大于100bp的有5160条，测长短于100bp的有813条，其余为空载。经统计分析，5160条ESTs共代表了4136个基因，其中含有575个叠连群(Contigs)和3561条单基因(Singlets)，平均冗余率为19.84％，平均读长为348bp。经生物信息学分析，998个为已知基因占总ESTs的24.13[％]，已知基因聚类后被初步归为22类，其中有在生物学上与sry、sox、卵黄蛋白原、卵黄蛋白原受体、细胞周期蛋白、泛素、热休克蛋白家族、抗氧化酶系统等基因具有相关性的序列。在测序及生物信息学分析的基础上，结合相关软件(Redhat Linux 9.0、apache、PHP、MySQL、wwwBLAST)构建了本地化的序列查询数据库，实现了EST数据的本地比对查询管理等功能。
　　 以进行EST测序的6816单克隆为模板，去除冗余的克隆后进行大规模扩增，纯化后用自动机械手点印至氨基化玻璃片基上制成含5664(59×96)个斑点的cDNA芯片。分别取等量成熟的雌雄个体的性腺总RNA以随机6碱基寡核苷酸作为引物进行逆转录，合成参入了aa-dUTP的单链cDNA，随后分别标记上Cy3和Cy5染料制成荧光探针去杂交印制在芯片上的探针，经激光共聚扫描仪采集电子图谱后用基于线性模型的基因芯片分析软件LimmaGUI进行数据线性化处理和基因表达图谱的分析。荧光强度比值大于2和小于0.5的基因定义为上调基因和下调基因，结果显示本研究中有23个基因在精巢中为上调表达基因17个基因为卵巢特异表达基因。