日本囊对虾性腺差异的蛋白质组学及其差异表达基因Cathepsin B的分析

摘要

日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）系甲壳动物，是我国东南沿海重要的经济养殖种类。近年来，随着对虾养殖业以及分子生物学技术的快速发展，与对虾性腺发育相关基因克隆与表达逐渐成为水产遗传育种的重点。但是人们对于对虾性腺差异的分子机制仍认识有限，关于对虾性腺差异蛋白质的表达研究更加缺乏，因此日本囊对虾性腺差异蛋白质组学研究将对阐明其分子机制有着重要的理论意义。 本研究首先采用一种能同时提取RNA、DNA和Protein的试剂（RDP试剂）进行日本囊对虾性腺总蛋白的制备，并通过双向电泳（2-DE）技术与传统的裂解液法比较提取效果。RDP法所得2-DE图谱清晰，条纹少，蛋白点数多，而裂解液法存在横向和纵向拖尾，其碱性端蛋白点大量缺失，说明RDP法能有效去除蛋白样品中盐离子、脂类等干扰成分。 利用双向电泳技术研究日本囊对虾性腺组织差异表达的蛋白，共筛选出45个差异蛋白，随机选取15个差异蛋白点进行MALDI-TOF/TOF MS分析，共鉴定出3种卵巢表达特异蛋白:组织蛋白酶B、皮质棒蛋白2、甲壳蓝蛋白A，5种卵巢表达上调蛋白:翻译控制肿瘤蛋白、角蛋白、磷酸丙糖异构酶、真核细胞翻译起始因子5A、NADPH异柠檬酸脱氢酶，2种卵巢表达下调蛋白:增殖细胞核抗原蛋白、Nesprin-1蛋白以及1种精巢特异表达蛋白过氧化物酶6。Gene Ontology(GO)分析显示皮质棒蛋白2、组织蛋白酶B等参与性腺发育以及配子发生中细胞周期的调控。 选取差异蛋白之一的组织蛋白酶B(cathepsin B)做进一步的研究。根据日本囊对虾近缘物种的cathepsinB基因的保守区域设计简并引物，并扩增出cathepsinB的部分基因片段。利用SMART-RACE技术克隆出其全长cDNA序列，该序列全长为1525bp，包括24 bp的5'非编码区，502bp的3'非编码区以及999bp的开放阅读框，共编码332个氨基酸，预测分子量约为36.9KDa，等电点为6.64。经SignalP3.0软件预测，得到该蛋白N端有17个氨基酸残基组成的信号肽序列。实时定量PCR结果显示cathepsinB在日本囊对虾的卵巢中表达量最高，精巢中基本不表达。 采用pGEX-4T-2载体构建cathepsinB编码区的重组表达载体pGEX-CTSB。该重组表达质粒经测序验证无误后将其转化到大肠杆菌BL21内进行表达，经IPTG诱导后的菌液通过SDS-PAGE检测表明融合蛋白分子量约为63KDa处，以包涵体形式存在。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 蛋白质组学概念及其差异蛋白质组学技术简介

1．1．1 基于凝胶差异分析技术

1．1．2 非凝胶差异分析技术

1．2 差异蛋白质组学技术在水生动物应激反应研究中的应用

1．2．1 非生物环境因子引起应激反应的差异蛋白质组学

1．2．2 病原微生物引起应激反应的差异蛋白质组学

1．2．3 展望

1．3 动物性腺差异的蛋白质组学研究进展

1．4 组织蛋白酶B(cathepsin B)的研究进展

1．5 日本囊对虾地理分布、形态特征及生活习性

1．6 本研究的背景和主要内容

1．7 本研究的技术路线

第2章 日本囊对虾性腺蛋白质双向电泳样品制备方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 日本囊对虾性腺蛋白质提取方法

2．2．2 测定蛋白质样品浓度

2．2．3 SDS-PAGE

2．2．4 双向电泳

2．3 结果

2．3．1 SDS-PAGE结果分析

2．3．2 双向电泳结果分析

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 日本囊对虾性腺差异蛋白质组学研究

3．1 材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要试剂

3．2 实验方法

3．2．1 RDP法提取日本囊对虾性腺蛋白质样品

3．2．2 Bradford法测定蛋白质样品浓度

3．2．3 SDS-PAGE

3．2．4 双向电泳

3．3 结果

3．3．1 日本囊对虾卵巢与精巢SDS-PAGE图谱的比较

3．3．2 日本囊对虾卵巢与精巢2-DE图谱的比较

3．3．3 差异蛋白点鉴定结果

3．4 讨论

3．5 小结

第4章 性腺差异表达蛋白Cathepsin B的基因克隆与表达分析

4．1 材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 主要仪器和试剂

4．1．3 引物

4．2 实验方法

4．2．1 基因全长的克隆

4．2．2 Real-time PCR检测相关基因在不同组织中的表达

4．2．3 原核表达重组载体的构建

4．2．4 重组表达载体的表达与纯化

4．3 结果

4．3．1 总RNA的提取结果

4．3．2 日本囊对虾Mj-CTSB基因序列分析

4．3．3 Mj-CTSB基因在日本囊对虾不同组织间的表达差异

4．3．4 重组表达质粒pGEX-CTSB的构建

4．3．5 重组表表达质粒tpGEX-CTSB在E．coli BL21中的表达及纯化

4．4 讨论

4．5 小结

第5章 总结与展望

致谢

参考文献

附录

在学期间发表的学术论文