黑曲霉JMU--TS528菌株的α--L--鼠李糖苷酶基因的克隆和表达分析

摘要

黑曲霉作为重要的酶制剂生产菌种，是美国食品药品监督管理局允许使用的食品用酶生产菌，它能合成一种具有很高商业价值的水解酶——α-L-鼠李糖苷酶。目前黑曲霉菌株的α-L-鼠李糖苷酶产量低、发酵成本高，且黑曲霉产α-L-鼠李糖苷酶需要诱导物，同时受到碳源代谢的调节。本文结合重叠PCR和RACE技术克隆了黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因（L-rha），通过建立SYBR Green实时定量PCR检测体系和方法探索了黑曲霉中L-rha和葡萄糖抑制基因（CreA）的表达情况，同时构建了可持续表达α-L-鼠李糖苷酶的基因工程菌。主要结果如下: 1.克隆到编码黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶的cDNA(KC750908.1)，命名为L-rha。该序列长2062 bp，3'非编码区长94 bp，最大开放阅读框的碱基数为1968，可编码655个氨基酸，1-17个氨基酸是信号肽。L-rha与白曲霉(AB374267.1)和黑曲霉513.88（XM001389049.1）中α-L-鼠李糖苷酶基因相似度很高，分别为93％和91％;根据同源建模的结果可知，它的空间结构和GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶相似，具有该家族典型的(α/α)6-barrel桶状结构。 2.黑曲霉JMU-TS528在以柚皮苷、橘皮苷、芸香苷和鼠李糖为唯一碳源时可分泌α-L-鼠李糖苷酶，以葡萄糖为唯一碳源时检测不到α-L-鼠李糖苷酶活性。检测黑曲霉中的L-rha和CreA表达情况，结果发现培养基中添加葡萄糖后，黑曲霉JMU-TS528发酵产物中的α-L-鼠李糖苷酶活性降低，L-rha表达量降低，CreA表达量上升。 3.将L-rha连接到表达载体pET32a和pPIC9K，构建重组载体pET-rha和pPIC9K-rha，分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115进行表达。在两种表达系统中都能诱导出重组蛋白，但大肠杆菌BL21（DE3）诱导出的是包涵体形式的蛋白，没有检测到α-L-鼠李糖苷酶活性;毕赤酵母工程菌GS115诱导表达7d后，酶活达到711.9 U/mL。 4.重组α-L-鼠李糖苷酶的最适pH为6.0，最适温度60℃，能够水解袖皮苷、橘皮苷、芸香苷、杨梅苷及pNPR。1、10和100mml/L的Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Ni2+和K+对重组酶有促进作用，1和10mmol/L的Na+、葡萄糖、L-鼠李糖、EDTA、DTT，10和100mmol/L的Fe3+，1mmol/L的Mn2+、10mmol/L的SDS、100mmol/L的Fe2+，以及β-巯基乙醇(1％、0.1％)对该酶有较强的抑制的作用。以柚皮苷为底物，在50℃、pH5.0、20mmol/L的柠檬酸盐缓冲体系中测得重组酶的Km为0.04mmol/L、Vmax为811.93U/mg。

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 引言

1．1 α-L-鼠李糖苷酶

1．1．1 α-L-鼠李糖苷酶的来源

1．1．2 α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用

1．1．3 α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究

1．1．4 α-L-广鼠李糖苷酶基因的表达研究

1．1．5 α-L-鼠李糖苷酶的结构生物学研究

1．2 黑曲霉

1．3 研究目的与意义

1．4 研究内容

1．4．1 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆及分析

1．4．2 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的表达差异分析

1．4．3 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的原核表达

1．4．4 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶因的真核表达

第2章 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆及分析

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 培养基和溶液的配制

2．1．5 引物

2．2 方法

2．2．1 黑曲霉JMU-TS528菌株的培养

2．2．2 黑曲霉JMU-TS528总RNA的提取

2．2．3 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

2．2．4 测序

2．2．5 序列分析

2．3 结果和分析

2．3．1 黑曲霉JMU-TS528总RNA的提取

2．3．2 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶cDNA的克隆

2．3．3 序列分析

2．4 小结

第3章 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的表达差异分析

3．1 材料

3．1．1 菌种

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 主要试剂及试剂盒

3．1．4 主要溶液和培养基的配制

3．1．5 引物

3．2 方法

3．2．1 黑曲零JMU-TS528菌株的活化

3．2．2 黑曲霉JMU-TS528菌株液态发酵α-L-鼠李糖苷酶酶活力的鉴定

3．2．3 不同碳源对黑曲零JMU-TS528菌株分泌α-L-鼠李糖苷酶的影响

3．2．4 酶活的测定

3．2．5 生物量的测定

3．2．6 发酵液残糖的测定

3．2．7 黑曲霉JMU-TS528总RNA的提取

3．2．8 cDNA链的合成

3．2．9 实时定量PCR检测基因的表达量

3．3 结果和分析

3．3．1 不同碳源对黑曲霉JMU-TS528菌株分泌α-L-鼠李糖苷酶的影响

3．3．2 添加葡萄糖对黑曲霉JMU-TS528产α-L-鼠李糖苷酶的影响

3．3．3 黑曲霉JMU-TS528总RNA的提取与检测

3．3．4 引物质量的检测

3．3．5 标准曲线的构建

3．3．6 黑曲霉JMU-TS528中L-rha的表达情况

3．4 小结

第4章 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的原核表达

4．1 材料

4．1．1 菌株及质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要培养基及溶液的配制

4．1．4 仪器设备

4．1．5 引物

4．2 方法

4．2．1 pET-rha的构建

4．2．2 原核表达和不溶性表达产物的纯化

4．2．3 SDS-PAGE电泳

4．2．4 表达条件的优化

4．2．5 酶活测定

4．3 结果和分析

4．3．1 pET-rha的构建

4．3．2 表达产物的检测

4．3．3 诱导条件的优化

4．3．4 不溶性表达产物的纯化

4．4 小结

第5章 黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达

5．1 材料

5．1．1 菌株及质粒

5．1．2 主要试剂溶液及培养基的配制

5．1．3 主要试剂

5．1．4 引物

5．2 方法

5．2．1 pPIC9K-rha的构建

5．2．2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备

5．2．3 电转化

5．2．4 筛选及鉴定

5．2．5 重组α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达

5．2．6 SDS-PAGE电泳检测

5．2．7 重组酶的分离纯化及质谱鉴定

5．2．8 重组α-L-鼠李糖苷酶酶学性质的测定

5．3 结果和分析

5．3．1 pPIC9K-rha的构建

5．3．2 阳性克隆的筛选

5．3．3 表达产物的酶活检测

5．3．4 表达产物的电泳检测

5．3．5 重组酶的分离纯化及质谱鉴定

5．3．6 重组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

5．4 小结

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文