二甲双胍通过miR-26a下调Mcl-1诱导人口癌细胞凋亡

摘要

目的：
　　以人口腔癌KB细胞为研究对象，研究二甲双胍对人口腔癌KB细胞体外增殖及凋亡的影响，并探讨二甲双胍对细胞影响的初步作用机制。
　　方法：
　　1.细胞经二甲双胍处理24h后，在倒置显微镜下观察KB细胞生长和形态学的变化。MTT法检测细胞存活率，平板克隆观察二甲双胍对口腔癌细胞体外克隆形成能力的影响；
　　2. KB细胞分组处理后，采用线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞内线粒体膜电位的变化情况；Annexin V-FITC/PI染色方法检测二甲双胍对KB细胞凋亡的影响；Western blot检测二甲双胍对KB细胞内Mcl-1，Bim，Bax及caspase-3蛋白的影响；
　　3. cDNA Mcl-1上调Mcl-1后，MTT，JC-1观察上调Mcl-1二甲双胍对KB细胞增殖及凋亡的影响；Western blot法检测口腔癌细胞中Mcl-1，Bim，Bax及caspase-3蛋白表达的变化；
　　4.qRT-PCR检测二甲双胍处理KB细胞后miR-26a表达水平的变化；
　　5.转染miR-26a后，集落克隆实验和PI单染实验分别用于检测KB细胞过表达miR-26a后，二甲双胍对转染mir-26a的KB细胞体外增殖及凋亡的影响是否发生变化，随后，再用蛋白印迹法检测Mcl-1表达的变化。
　　结果：
　　1.不同浓度的二甲双胍对人口腔癌KB细胞体外增殖及凋亡的影响
　　1)形态学结果显示，经不同浓度二甲双胍处理后，KB细胞可出现形态变圆，体积缩小，部分细胞发生边集并破裂成细胞碎片等显著的形态学变化。随着二甲双胍浓度的增加贴壁细胞数目逐渐减少，漂浮细胞逐渐增多；
　　2)MTT细胞活力检测结果显示，二甲双胍可降低人口腔癌KB细胞的活力。与对照组相比，二甲双胍处理组的细胞活力明显降低，并呈现药物浓度和时间依赖的关系；
　　3)平板克隆形成实验显示二甲双胍可显著抑制KB细胞的克隆形成能力；
　　4)Annexin V-FITC/PI染色显示二甲双胍能诱导细胞发生凋亡，并呈浓度依赖性。
　　5)JC-1荧光检测，红绿荧光的相对比例降低，提示线粒体膜电位下降；
　　6)Western blot结果表明二甲双胍能显著下调口腔癌细胞中Mcl-1的表达，上调Bim、Bax的表达水平，并诱导caspase-3的活化。
　　2.过表达Mcl-1能够降低口腔癌KB细胞对二甲双胍的敏感性
　　1)cDNA Mcl-1转染效率的检测
　　将cDNA Mcl-1和空质粒转染进入口腔癌细胞KB中，Western blot结果显示转染cDNA Mcl-1组中Mcl-1表达明显升高；
　　2)cDNA Mcl-1转染降低口腔癌细胞对二甲双胍的敏感性
　　MTT结果显示转染cDNA Mcl-1后KB细胞的存活率较未转染细胞明显提高，提示cDNA Mcl-1降低了KB细胞对二甲双胍的敏感性；JC-1结果显示转染cDNA Mcl-1能抑制二甲双胍引起的线粒体膜电位的下降。Western blot表明Mcl-1的高表达抑制了KB细胞在二甲双胍作用下细胞内Bax及Bim蛋白的表达和Caspase-3的活性。
　　3.二甲双胍对KB细胞miR-26a的调节及miR-26a对细胞增殖凋亡的影响
　　1)与对照组相比，二甲双胍可明显上调细胞中miR-26a的表达水平；
　　2)用miR-26a的模拟物和抑制物分别转染KB细胞，结果显示，转染miR-26a模拟物后，与二甲双胍单独处理组相比较，KB细胞的增殖受到明显抑制，而miR-26a的抑制物则出现相反的结果。进一步试验发现，miR-26a的模拟物转染KB细胞后，Mcl-1水平明显降低，且细胞凋亡率明显增加。
　　结论：
　　1.二甲双胍能显著抑制KB细胞的增殖并且诱导细胞凋亡；
　　2.上调Mcl-1后能降低口腔癌KB细胞对二甲双胍的敏感性；
　　3.二甲双胍刺激口腔癌KB细胞后上调miR-26a的表达；
　　4.二甲双胍对口腔癌增殖及凋亡的影响可能与二甲双胍上调miR-26a表达有关。

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中文摘要

英文摘要

引言

材料与仪器

1 材料

2 仪器

方法

1 KB细胞的培养

2. 药物的配制

3. 形态学观察

4. MTT 法检测细胞存活率

5. 集落克隆形成实验检测药物对细胞增殖抑制作用

6. PI 染色流式细胞术检测细胞凋亡

7. Annexin V/PI 双染法流式细胞术检测细胞凋亡

8. 线粒体膜电位的检测

9. 免疫印迹法检测相关蛋白的表达

10.荧光定量 RT-PCR 检测 miR-26a 表达

11.miRNA瞬时转染

12. 统计学分析

结果

1. 二甲双胍对口腔癌KB细胞增殖的影响

2. 二甲双胍对KB细胞凋亡的影响

3. 二甲双胍诱导口腔癌KB细胞凋亡的机制研究

4. 上调Mcl-1降低口腔癌KB细胞对二甲双胍的敏感性

5. qRT-PCR 检测二甲双胍刺激口腔癌KB细胞后 miR-26a 的表达

6. 过表达 miR-26a 增强口腔癌癌细胞的凋亡敏感性

讨论

结论

参考文献

致谢

附录 A英中文术语缩略语表

附录B常用试剂配制方法

附录 C个人简历及发表论文

附录 D综述: 二甲双胍抗肿瘤作用研究进展