酶法交联结合热处理对青蟹精氨酸激酶致敏性的影响

摘要

蟹类作为一种营养丰富，肉质鲜美的优质水产品，广受大家喜欢，随之而来引发的食物过敏病例也是逐年增多，严重的影响了人们的生活质量，因此对过敏原的消减已经成为热门研究方向。酶法交联因为可以改善蛋白质的功能和结构，被广泛应用于食品加工中，近期有研究表明其对过敏原致敏性也有一定的影响，但对甲壳类过敏原致敏性的影响并无报道。本文以精氨酸激酶（ariginine kinase, AK）为试验对象，研究酶法交联结合热处理对AK致敏性的影响，并深入探究其交联位点，阐明致敏性改变的原因，为开发低致敏性产品提供理论依据。
　　本研究首先从拟穴青蟹中纯化得到天然 AK，从大肠杆菌体外表达获得重组 AK（recombinant ariginine kinase, rAK），对两者的差异进行分析，结果显示，rAK与AK在消化稳定性和免疫结合活性方面没有差别；在结构方面，rAK游离巯基含量和疏水性高于AK，蛋白质分子空间结构折叠松散，导致其热稳定性下降。
　　为了研究酶法交联在消减AK致敏性方面的作用，首先对用于交联的酶进行了筛选，结果显示，谷氨酰胺转移酶与辣根过氧化物酶均不能有效促进AK交联。酪氨酸酶可促进AK交联，其反应条件为 AK经45℃热处理30 min后，在1600 U/mL酪氨酸酶和0.06μmo l/mL咖啡酸的作用下反应8 h。
　　在建立的酶法交联结合热处理条件下，采用蛋白组学和免疫组学方法分析AK的交联程度、消化稳定性、交联产物（cross-linked thermal polymerized ariginine kinase, CL-pAK）的免疫结合活性，又进一步通过建立RBL-2H3细胞模型和BALB/c小鼠过敏模型评价其致敏性。电泳及电镜结果显示，在咖啡酸和酪氨酸酶催化下AK能够有效交联，产生大分子物质。AK发生交联后更耐胃蛋白酶消化，且消化产物IgG/IgE结合活性降低。抑制性ELISA检测结果显示，AK交联后的半抑制浓度由1.13μg/mL升高至228.36μg/mL。BALB/c小鼠过敏模型结果显示，CL-pAK组与AK组相比，血清IgE、IgG1含量分别降低92.3％和82.3%，组胺含量下降55.73%，脾脏细胞细胞因子IL-4、IL-13明显降低，但是小鼠对CL-pAK并没有显示出免疫耐受。细胞实验证实CL-pAK能够降低RBL-2H3细胞的组胺释放量和肥大细胞脱颗粒程度。结果表明，酶法交联结合热处理消减了青蟹精氨酸激酶致敏性，为加工生产低致敏性蟹类制品提供了技术依据。

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第1章 引言

1.1 食物过敏及其过敏原

1.2 甲壳类水产品过敏原

1.3 低致敏性食品加工技术

1.4 本研究的目的及意义

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第3章 结果与分析

3.1 AK重组表达及性质分析

3.2 酶法交联加工方法的建立

3.3 酪氨酸酶结合热处理对AK致敏性的影响

第4章 讨论

4.1 AK的重组表达及性质分析

4.2 酶法交联加工方法的建立

4.3 酪氨酸酶结合热处理对AK致敏性的影响

第5章 结论和展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文