水产品中四环素类药物胶体金免疫层析试纸条的研制

摘要

四环素类药物主要包括四环素、土霉素、金霉素等，由于较高浓度时其具有良好的杀菌作用，所以被广泛的应用于各个领域，也就不可避免的出现了滥用现象，造成了严重的药物残留。而四环素类药物可引起人类的过敏反应等一系列疾病，对人体和环境具有严重的危害。现阶段针对于四环素类药物的检测方法存在着操作繁琐、检测费用高等不适合推广使用的缺点，建立快速灵敏的四环素类药物检测方法十分必要。
　　胶体金免疫层析试纸条法自发现至今已在多个领域被普遍使用，主要就是其快速高效、安全简便。本文对试纸条制备过程中的条件进行探索和优化，从而制得灵敏度高的四环素类药物胶体金免疫层析试纸条。
　　本文胶体金的制备主要是利用柠檬酸三钠还原法，并通过研究对制备过程中影响因素进行优化，最终在先加入100 mL0.01％的氯金酸溶液，后加入0.5 mL4％柠檬酸三钠溶液，在转速是200 r/min，溶液变红后控制温度档是400℃（沸腾时实际温度为100℃），加热时间是10 min条件下制得了本试验所需粒径为20 nm左右胶体金溶液。
　　将制得的胶体金放置至室温后用0.22μm滤膜进行过滤，并取过滤后的胶体金利用紫外可见分光光度计对其进行光谱扫描，从而可以初步判定胶体金的质量。经过初步判定合格的胶体金，可以用来进行下一步胶体金标记抗体试验。通过对影响胶体金标记的溶液pH、标记时间、加入抗体的稀释倍数、抗体的具体加入量等进行了系列的研究，在1 mL胶体金溶液中加入5μL0.2 mol/L的K2CO3使溶液的pH大约为8.0，标记时间为30 min，抗体稀释倍数是6倍、抗体加入量是9.6μg条件下制得了所需金标抗体，并对所制得金标抗体质量进行了初步判定。
　　通过对NC膜的选择，包被液巾离子强度、包被浓度、金标垫前处理等因素的研究，在使用Millipore135型号的NC膜，包被液中NaCl的浓度为8.5 g/L，检测线上使用浓度为1.0 mg/mL的四环素类抗原进行包被，质控线上使用浓度是0.75 mg/mL羊抗鼠二抗进行包被的条件下制得了本试验所需试纸条。并对试纸条针对标准品的检测灵敏度、针对相似结构物质的特异性、自身稳定性、同批或不同批次之间的重复性等进行了研究。
　　本文最终所制得的试纸条，对四环素标准品的检测灵敏度为20μg/L、金霉素标准品的灵敏度为20μg/L、土霉素标准品的灵敏度为25μg/L。在对虾肉的实际检测中，本试纸条的灵敏度可达80μg/kg。

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 绪论

1．1 四环素类药物在水产品中的残留情况

1．2 四环素类药物残留的检测技术

1．2．1 四环素类药物的理化性质

1．2．2 四环素类药物的作用机理

1．2．3 四环素类药物残留的危害

1．2．4 四环素类药物残留限量标准

1．2．5 四环素类药物的检测方法

1．3 胶体金免疫层析技术

1．3．1 胶体金的制备

1．3．2 金标抗体的制备

1．3．3 试纸条的组装

1．3．4 胶体金免疫层析技术的优点

1．3．5 现有快速检测四环素类药物残留的产品

1．4 研究目的和意义

1．5 本课题主要研究内容

1．5．1 胶体金的制备

1．5．2 金标抗体的制备及纯化

1．5．3 试纸条的组装

1．5．4 样品前处理

1．5．5 试纸条性能检测

第2章 胶体金的制备及鉴定

2．1 实验试剂及材料

2．2 实验仪器及设备

2．3 常用溶液的配置

2．4 实验方法

2．4．1 试验所用容器的清洗

2．4．2 胶体金制备条件的优化

2．4．3 胶体金的制备

2．4．4 胶体金质量的鉴定

2．5 结果与讨论

2．5．1 氯金酸与柠檬酸三钠加入顺序对胶体金制备的影响

2．5．2 柠檬酸三钠浓度对胶体金制备的影响

2．5．3 转速对胶体金制备的影响

2．5．4 溶液变红后继续加热反应的时间对胶体金制备的影响

2．5．5 胶体金的质量鉴定

2．6 本章小结

第3章 金标抗体的制备及鉴定

3．1 试验试剂及材料

3．2 常用溶液的配制

3．3 试验方法

3．3．1 胶体金最佳抗体标记量的确定

3．3．2 胶体金最佳标记pit的确定

3．3．3 抗体稀释倍数对胶体金标记结果的影响

3．3．4 标记时间对胶体金标记结果的影响

3．3．5 金标抗体的制备及纯化

3．3．6 金标抗体的质量鉴定

3．4 结果与讨论

3．4．1 胶体金最佳抗体标记量的确定

3．4．2 胶体金最佳标记pH值的确定

3．4．3 抗体稀释倍数对胶体金标记效果的影响

3．4．4 标记时间对胶体金标记效果的影响

3．4．5 金标抗体的纯化

3．4．6 金标抗体质量的鉴定

3．5 本章小结

第4章 四环素类药物胶体金免疫层析试纸条的制备

4．1 试验试剂与材料

4．2 实验方法

4．2．1 试纸条组成材料的选择

4．2．2 金标结合垫及样品垫的前处理方法的确定

4．2．3 抗原抗体的包被

4．2．4 试纸条的组装

4．3 结果与讨论

4．3．1 试纸条组成材料的选择

4．3．2 金标结合垫及样品垫的前处理方法的确定

4．3．3 抗原抗体的包被

4．4 本章小结

第5章 四环素类药物胶体金免疫层析试纸条性能检测

5．1 性能检测

5．1．1 灵敏度测试

5．1．2 特异性测试

5．1．3 稳定性测试

5．1．4 重复性测试

5．2 结果与讨论

5．2．1 试纸条灵敏度结果

5．2．2 试纸条特异性测试结果

5．2．3 试纸条稳定性测试结果

5．2．4 试纸条重复性测试结果

5．3 本章小结

第6章 样品测试

6．1 方法

6．2 测定

6．2．1 试纸条测试

6．2．2 液质联用测试

6．3 结果与讨论

6．4 本章小结

第7章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

致谢

参考文献