杂色鲍变态中ⅡS信号通路对细胞凋亡和增殖的作用分析

摘要

杂色鲍（Haliotis diversicolor）是一种重要的经济贝类，其生活史中存在附着变态过程。本研究在实验室获得的杂色鲍转录组数据基础上，采用SMART-RACE技术克隆获得胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路(ⅡS)中的胰岛素诱导蛋白和胰岛素降解酶，分别命名为HdINSIG2和HdIDE。结合qPCR、原核表达、酶联免疫、RNAi和原位杂交技术研究了ⅡS信号通路成员HdINSIG2、HdIDE、HdIG FBP7和HdMIRP对杂色鲍幼虫细胞增殖和凋亡的作用。主要结果如下:
　　1)HdINSIG2cDNA全长为1400bp;其中5'UTR为123bp，3'UTR为677bp，ORF为600bp;编码199个氨基酸;含有5个跨膜结构域。qRT-PCR显示，在胚胎发育过程中，HdINSIG2在幼虫发育的卵裂阶段表达量相对较高;胚后阶段表达量显著低于卵裂阶段(P＜0.05)。
　　2)HdIDE cDNA长为4244bp;其中5'UTR为118bp，3'UTR为1054bp，ORF为3072bp;编码1023个氨基酸;包含一个典型的蛋白酶M16功能域和两个蛋白酶M16C功能域。此外，HdIDE包含一个高度保守的HxxEH基序、Zn2+崔化位点以及与底物结合的位点。qRT-PCR显示，HdIDE在胚胎各发育阶段均有表达，表达水平略有波动;呈现明显的高-低-高-低-高的波动表达模式。
　　3)构建pGEX-4T-2-HdIGFBP7和pGEX-4T-2-HdMIRP原核表达载体，转化原核表达菌株BL21。IPTG诱导表达，SDS-PAGE分别检测到约为51kDa和39kDa的目的条带。经Ni亲和层析柱纯化目的蛋白后，制备多克隆抗体。ELISA间接法检测HdIGFBP7和HdMIRP多克隆抗体效价分别为51200和6400。
　　4)RNAi实验结果显示:添加HdINSIG2和HdIDE的dsRNA后，与对照组相比幼虫的变态率和死亡率无显著变化(P＞0.05)。诱导实验结果显示:添加GABA组幼虫变态率极显著高于阴性对照组(P＜0.01);添加HdIGFBP7融合蛋白组变态率显著高于阴性对照组(P＜0.05);添加HdMIRP融合蛋白组变态率与阴性对照组不存在显著差异(P＞0.05)。并且GABA组、HdIGFBP7组和HdMIRP组幼虫死亡率显著低于阴性对照组（P＜0.05）。
　　5)采用原位杂交法检测幼虫细胞增殖和凋亡情况。结果显示:HdINSIG2干扰后，HdCaspase3、HdH3和HdP NA显色位置以及颜色的深浅同对照组结果无显著差异。HdIDE干扰后，腹侧内脏团和内脏团近背侧检测到HdCaspase3的表达，而阴性对照和空白对照组只在腹部内脏团处检测到阳性信号;HdH3和HdPCNA显色位置与对照组一致，但显色较浅。添加HdIGFBP7和HdMIRP融合蛋白后，腹侧内脏团和内脏团近背侧检测到HdCaspase3的表达，而阴性对照和空白对照组只在腹部内脏团处检测到阳性信号;HdH3和HdPCNA显色位置与对照组一致，但显色较深。它们的显色结果与GABA组类似。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 海洋无脊椎动物幼虫附着变态的研究进展

1．1．1 海洋无脊椎动物个体发育

1．1．2 海洋无脊椎动物幼体变态研究进展

1．2 ⅡS信号通路与细胞增殖的关系

1．2．1 细胞增殖的概念

1．2．2 细胞增殖的特征

1．2．3 细胞增殖的检测法

1．2．4 ⅡS信号通路与细胞增殖的关系

1．3 ⅡS信号通路与细胞凋亡的关系

1．3．1 细胞凋亡的概念

1．3．2 细胞凋亡的特征

1．3．3 细胞凋亡检测方法

1．3．4 ⅡS信号通路与细胞凋亡的关系

1．4 胰岛素诱导蛋白基因的研究进展

1．5 胰岛素降解酶基因的研究进展

1．6 本研究的目的和意义

1．7 主要研究内容

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要仪器和试剂

2．1．3 主要试剂的配制方法

2．1．4 引物

2．2 实验方法

2．2．1 杂色鲍各组织总础悄的提取(RDP法)

2．2．3 SMART-RACE技术获取基因全长

2．2．4 割胶纯化目的片段并连接载体

2．2．5 感受态细胞的转化、筛选及测序

2．2．6 目的基因的生物信息学分析

2．2．7 HdIGFBP7和HdMIRP的原核表达

2．2．8 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．2．9 Ni亲和层析法纯化外源蛋白

2．2．10 目的蛋白抗体的制备

2．2．11 酶联免疫分析(ELISA)

2．2．12 亲贝的培养繁育及样品采集

2．2．13 实时荧光定量PCR及数据分析

2．2．14 杂色鲍幼虫RNA干扰实验

2．2．15 杂色鲍幼虫诱导实验

2．2．16 整胚原位杂交

第3章 结果

3．1 杂色鲍各组织总RNA的抽提结果

3．2 目的基因的扩增结果

3．3 HdINSIG2生物信息学分析

3．3．1 HdINSIG2 cDNA序列分析

3．3．2 同源分析与系统发育分析

3．3．3 HdINSIG2三级结构预测

3．4 HdIDE生物信息学分析

3．4．1 HdIDE cDNA序列分析

3．4．2 同源分析与系统发育分析

3．4．3 HdIDE三级结构预测

3．5 HdPCNA生物信息学分析

3．5．1 HdPCNA cDNA序列分析

3．5．2 同源分析与系统发育分析

3．5．3 蛋白质三级结构预测

3．6 HdH3生物信息学分析

3．6．1 HdH3 cDNA序列分析

3．6．2 同源分析与系统发育分析

3．6．3 蛋白质三级结构预测

3．7 重组表达载体的构建

3．8 原核表达与蛋白纯化

3．9 ELISA间接测定抗体效价

3．10 dsRNA的制备

3．11 RNAi对幼虫发育的影响

3．12 诱导对幼虫发育的影响

3．13 幼虫发育过程中基因表达情况

3．14 幼虫在RNAi和诱导刺激下凋亡和增殖基因的原位表达

第4章 讨论

4．2 HdIDE在幼虫变态过程中的作用分析

4．3 HdIGFBP7与HdMIRP在变态过程中的作用分析

第5章 总结与展望

致谢

参考文献

在学期间科研成果情况