Hr基因和ilvB-1基因在嗜水气单胞菌胞内存活中的功能研究

摘要

传统观点认为，胞内存活是专性胞内致病菌致病过程中重要的一个环节，是专性胞内菌为抵抗宿主巨噬细胞的杀灭作用及进一步传播感染形成的策略。但是近年来的研究发现，非专性胞内菌也可以在巨噬细胞中存活，并且病原菌胞内存活能力是决定致病菌毒力的一个重要因子。然而非专性胞内菌在吞噬细胞内存活的研究目前主要局限于金黄色葡萄球菌，其他非专性胞内菌吞噬细胞内存活的研究还鲜有报道。本实验室前期研究发现，水产动物病原性嗜水气单胞菌可以在宿主鱼鳗鲡的吞噬细胞中存活一定时间，但对其存活的机制的研究才刚刚起步。因此，本研究继续以从患病鳗鲡中分离得到的嗜水气单胞菌作为研究对象，探索该病原菌在宿主巨噬细胞中存活的分子机制。
　　首先采用Mini-Tn10转座子随机插入突变技术构建了嗜水气单胞菌胞内存活突变体库，并从中筛选了2株胞内存活能力下降并表现稳定的突变株M85和M159。通过PCR鉴定和Southern blot杂交验证了这两株突变株均是由Mini-Tn10单位点插入突变的。接着，我们采用TAIL-PCR技术分别扩增突变株转座子插入位点侧翼的序列，通过测序与拼接，获得目的基因全长序列。经在线BLAST比对，结果表明:M85突变株转座子插入位点为Hr基因，该ORF编码一个含183个氨基酸的蛋白，同源性分析结果与A hydrophila ATCC7966的蚯蚓血红蛋白同源性高达98％;M159突变株转座子插入位点为ilvB-1基因，该ORF编码一个含573个氨基酸的蛋白，与A hydrophila ATCC YL17的乙酰乳酸合酶同源性高达98％。
　　为了进一步研究Hr基因和ilvB-1基因在嗜水气单胞菌胞内存活过程中的功能，我们利用表达载体pACYC184质粒构建补偿系统pACYC184-Hr和pACYC184-ilvB-1，通过电击转化法将重组表达质粒分别导入相应的突变株中，成功地构建了互补菌株C85和C159，并且通过western blot验证了该质粒在互补菌株中正常表达了相应的蛋白。
　　最后，本文通过胞内存活、运动性、过氧化氢敏感性、生物膜形成等试验，我们分析了Hr基因和ilvB-1基因的在嗜水气单胞菌胞内存活阶段的功能。结果推测:Hr基因的功能可能包括两个方面，其一:是作为氧传感器，感受巨噬细胞内氧气浓度变化，从而改变其呼吸效率等代谢过程;其二是对抗呼吸爆发，通过修复铁硫蛋白簇来对抗ROS的杀灭作用。而ilvB-1基因的功能推测为合成生长所必需的支链氨基酸，从而维持其在胞内严峻环境下的生长。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 嗜水气单胞菌概述

1．2 嗜水气单胞菌流行病学

1．3 嗜水气单胞菌致病因子

1．3．1 毒力相关的分泌物质

1．3．2 致病相关的表面物质

1．4 细菌胞内存活的研究现状

1．4．1 胞内存活的研究意义

1．4．2 非胞内病原菌胞内存活的研究现状

1．4．3 胞内存活的机制

1．4．4 细菌胞内存活的可能影响因素

1．5 研究内容与目的

1．5．1 研究内容与路线图

1．5．2 研究目的

第2章 嗜水气单胞菌胞内存活突变库的构建、筛选和鉴定

2．1 材料

2．1．1 试验用菌和鱼

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 构建突变库

2．2．2 嗜水气单胞菌胞内存活缺陷突变株的筛选

2．2．3 PCR鉴定突变株

2．2．4 Southern blot

2．2．5 TAIL-PCR鉴定突变株DNA序列

2．3 结果与分析

2．3．1 转化前后的pLOF／Km质粒提取

2．3．2 巨噬细胞的提取与分离

2．3．3 胞内存活突变株的筛选

2．3．4 Southern blot

2．3．5 突变基因序列结果

2．4 讨论

第3章 嗜水气单胞菌Hr和ilvB-1基因互补菌株的构建

3．1 材料

3．1．1 试验用菌和载体

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 TA克隆

3．2．2 重组表达载体的构建

3．2．3 重组表达载体的转化

3．2．4 重组质粒的筛选和鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 目的基因的PCR扩增

3．3．2 重组质粒T-Hr和T-ilvB-1和pACYC184表达载体双酶切

3．3．3 菌液PCR验证和双酶切验证

3．3．4 Western bloting

3．4 讨论

第4章 Hr和ilvB-1基因在嗜水气单胞菌胞内存活中的功能研究

4．1 试验材料

4．1．1 试验菌株和鱼

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．2 ilvB-1基因的生物学功能试验

4．3 结果与分析

4．3．1 Hr基因的生物学功能试验结果

4．3．2 ilvB-1基因的生物学功能试验结果

4．3 讨论

5．1 小结

5．2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文