活血补肾汤对激素性股骨头坏死VEGF及OPG/RANKL表达的影响

摘要

研究目的:
　　 本研究通过动物实验的方法,从组织形态学和细胞分子水平,研究活血补肾汤对VEGF及OPG、RANKL的表达的影响,探讨激素性股骨头坏死的发病机制及活血补肾汤治疗激素性股骨头坏死的作用机制,为活血补肾汤的治则治法提供实验基础和理论依据。
　　 研究方法：
　　 1.活血补肾汤对兔激素性股骨头坏死VEGF的影响
　　 1.1、将130只新西兰大白兔分为5组:正常对照组、激素模型组、高(12.88g/kg·d)、中(9.66g/kg·d)、低(6.44g/kg·d)剂量活血补肾汤中药治疗组(造模按Matsui造模法)。正常对照组及激素模型组每日生理盐水10ml灌胃。中药治疗组每日给予不同浓度的活血补肾汤中药灌胃。连续给药后,于第4、8、12周分批取材。
　　 1.2、显微镜下观察各组兔股骨头的组织形态并空骨陷窝记数。
　　 1.3、采用免疫组织化学SP法进行血管内皮生长因子(VEGF)的测定。
　　 2.活血补肾汤对兔激素性股骨头坏死血清OPG/RANKL的影响。
　　 2.1、动物分组、造模、给药同上。
　　 2.2、给药4、8、12周时每组各取8只大白兔腹主动脉取血3ml,离心后收集血清,保存备用。
　　 2.3、采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测兔血清OPG、RANKL含量。
　　 3.活血补肾汤含药血清对大鼠成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达的影响。
　　 3.1、取新生SD大鼠的颅盖骨进行成骨细胞原代及传代培养。取3代生长期成骨细胞,显微镜镜下观察进行成骨细胞鉴定。
　　 3.2、 SD大鼠12只,分为4组(生理盐水对照组、高、中、低剂量活血补肾汤中药组),每组3只。对照组大鼠3ml生理盐水灌胃,高、中、低剂量中药组大鼠按不同浓度3ml活血补肾汤灌胃,每天两次,连续3天。各组于末次灌胃后2小时股动脉取血。离心后收集血清,保存备用。
　　 3.3、大鼠成骨细胞分别置于含各组血清(浓度20％)的培养基中,放入培养箱中培养。
　　 3.4、 RT-PCR方法对各组成骨细胞的OPG、RASKLmRNA表达进行半定量检测。
　　 结果：
　　 1.HE观察：
　　 激素模型组:骨小梁稀疏、结构紊乱,骨髓细胞大量减少,骨髓多被脂肪细胞填充,骨细胞数量减少,空骨陷窝增多；中药治疗组在实验期内的骨小梁结构基本完整。高、中剂量中药组第8、12周骨小梁表面形成新的骨细胞和骨组织。
　　 2.VEGF的表达。
　　 第4周时,高、中、低剂量中药组及模型组VEGF表达明显高于正常对照组(P<0.01)。中、低剂量组VEGF表达高于模型组(P<0.05)；第8周时,高、中、低剂量中药组VEGF表达明显高于模型组(P<0.01)；第12周时,高、中、低剂量中药组VEGF表达明显高于模型组(P<0.01)。
　　 3.OPG、RANKL血清含量。
　　 第4周:高、中、低剂量中药组、正常对照组OPG含量均显著高于模型组(P<0.01)。第8周:模型组OPG含量显著低于高、中、低剂量中药组及正常对照组(P<0.01)。高、中、低剂量组明显高于正常对照组(P<0.01).第12周:高、中、低剂量中药组、正常对照组OPG含量均显著高于模型组(P<0.01).模型组RASKL含量4、8、12周均显著高于高、中、低剂量组及正常对照组(P<0.01)。
　　 4.成骨细胞OPG、RASKLmRNA表达值。
　　 高、中剂量中药组OPGmRNA表达值高于生理盐水对照组(P<0.05)。高、中、低剂量组之间无明显差异。RANKLmRNA表达值:高、中剂量中药组明显低于生理盐水对照组(P<0.01)。低剂量中药组低于生理盐水对照组(P<0.05)。高剂量中药组低于低剂量中药组(P<0.05).
　　 结论：
　　 1.激素性股骨头坏死局部VEGF的表达降低,抑制了血管与骨的再生。
　　 2.活血补肾汤能够增强坏死股骨头局部VEGF的表达。
　　 3.激素性股骨头坏死兔血清OPG含量下降,RANKL含量上升,OPG/RASKL比值降低.
　　 4.活血补肾汤能够提高血清OPG含量,降低RANKL含量,升高OPG/RASKL比值。
　　 5.活血补肾汤能够上调OPG mRNA的表达,下调RANKL mRNA的表达,OPG/RASKL是活血补肾汤的药物作用靶点之一。

目录

文摘

英文文摘

中英文缩略词表

前言

实验一 活血补肾汤对兔激素性股骨头坏死VEGF的影响

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

实验二活血补肾汤对兔激素性股骨头坏死血清OPG/RANKL的影响

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

实验三活血补肾汤含药血清对大鼠成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达的影响

一、大鼠的成骨细胞培养

实验材料

实验方法

结果

二、活血补肾汤含药血清对大鼠成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达影响

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

致谢

附图

文献综述

参考文献

作者简历