仙茅酚苷类成分抗骨质疏松及雌激素作用研究

摘要

中药仙茅来源于石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaerm.的干燥根茎,味辛、性热、有毒,具有补肾阳、益精血、强筋骨、祛寒湿等功效,具有调节免疫、抗骨质疏松、保肝、保护心血管系统等多种药理活性。仙茅的主要化学成分为酚类成分及其衍生物、环菠萝蜜烷型三萜皂苷、木脂素,黄酮等。本课题组研究发现仙茅乙醇提取物能够减少去卵巢骨质疏松大鼠骨质的丢失,具有抗骨质疏松作用。活性成分筛选结果表明仙茅抗骨质疏松的活性成分为酚苷类成分。基于上述研究基础,本课题着重进行了以下几方面研究:
　　 建立了仙茅中苔黑酚葡萄糖苷,仙茅苷,仙茅素A的HPLC含量测定方法。以仙茅中三种代表性酚苷类成分苔黑酚葡萄糖苷,仙茅苷,仙茅素A的含量为考察指标,以HPLC进行含量测定,考察乙醇浓度、提取次数、提取时间、溶剂倍量对酚苷类成分提取效率的影响,通过四因素三水平L9(34)正交试验确定仙茅酚苷类成分的最佳提取方法。优选出的最佳提取工艺为10倍量70％7,醇回流提取3次,每次120分钟。以优化的提取工艺提取仙茅药材,调整提取液浓度为每毫升含1g原药材,以1:1的上样量(药液体积:树脂床体积),上样于D101大孔树脂,待吸附后,分别以水、10％、20％、30％、40％、50％、60％的乙醇洗脱,HPLC检测洗脱液,确定10％乙醇洗脱部位富含苔黑酚类酚苷,30％乙醇部位富含苯甲酸酯类酚苷仙茅苷和仙茅素A。将10％乙醇洗脱部位和30％乙醇洗脱部位用水溶解后分别再上D101大孔树脂,分别收集10％乙醇洗脱部位和30％乙醇洗脱部位,浓缩干燥后,10％乙醇洗脱部位苔黑酚葡萄糖苷含量达39％:30％乙醇洗脱部位仙茅苷和仙茅素A含量分别为46％和4％。通过D101大孔树脂柱、凝胶柱、ODS反相柱、MCI柱,制备液相对10％乙醇洗脱部位和30％乙醇洗脱部位进行化学成分的分离鉴定,共分离得到10个化合物。其中8个为仙茅酚苷类成分,2个为呋喃类化合物。
　　 以三月龄去卵巢雌性大鼠为模型考察仙茅提取物及仙茅酚苷类成分的抗骨质疏松作用。研究发现雌性大鼠去卵巢后,子宫萎缩,已造成绝经状态;血清碱性磷酸酶活性升高,U-Ca/Cr值升高,股骨骨密度降低,血清抗氧化酶活力水平下降,脂质过氧化物含量升高。仙茅提取物及不同剂量的苯甲酸酯类酚苷成分均能提高去卵巢大鼠的骨密度,且中、高剂量组大鼠骨密度与去卵巢模型组大鼠比较具有显著性差异(P＜0.01)。仙茅苔黑酚类酚苷成分对去卵巢大鼠骨密度的作用不显著。这表明仙茅的抗骨质疏松活性成分为其所含的苯甲酸酯类酚苷,如仙茅苷等,这些成分通过抑制骨吸收减少骨质的丢失。代谢组学和血清抗氧化酶活性分析表明仙茅酚苷类成分通过提高机体的抗氧化能力改菩骨代谢,减少骨质的丢失。
　　 选用17天龄性未成熟的雌性SD大鼠幼鼠,以子宫湿重与100g体重之比作为评价仙茅雌激素样活性的指标,考察了仙茅乙醇提取物及各D101大孔树脂的纯化部位的雌激素样作用,研究结果表明仙茅总提物及其各纯化部位均无明显的雌激素样作用。选用雌激素受体阳性细胞模型(MCF-7)考察了仙茅中的酚类化合物:仙茅苷、仙茅素A、2,6-二甲氧基苯甲酸、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龙胆二糖苷对MCF-7细胞的增殖作用的影响,结果发现阳性药雌二醇(E2)则具有显著促细胞增殖作用,各受试药物对细胞增殖无明显作用,推断仙茅各受试药物即无雌激素样作用。去卵巢大鼠给予苔黑酚类酚苷和苯甲酸酯类酚苷12周后,其雌激素受体阳性器官乳腺、阴道和子宫的组织构造与去卵巢对照大鼠相比较没有显著变化,但其孕激素受体、雌激素受体α和β的表达有一定程度的降低,这些结果说明仙茅苔黑酚类酚苷和苯甲酸酯类酚苷具有抗雌激素样作用。
　　 综上所述,本课题获得了仙茅酚苷类成分的制备方法,分离鉴定了其中主要的酚苷类化合物,阐明了其抗骨质疏松和抗雌激素样作用的物质基础。通过抗骨质疏松和雌激素样活性分析,初步明确了仙茅酚苷类成分通过抗氧化和抗雌激素样作用抑制骨丢失的作用机制。不足之处在于仙茅酚苷类成分抗雌激素样作用的研究尚不够全面深入,有待在以后的研究中补充、完善,以揭示仙茅酚苷类成分抗雌激素样作用的特点,明确其可能对生物或人体产生的有益或不利作用。