雷公藤免疫抑制活性单体筛选及对HL-7702细胞毒性研究

摘要

雷公藤系卫矛科雷公藤属植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.多年生藤本植物，是一种常用的中草药，临床上常用来治疗类风湿关节炎、肾脏疾病及皮肤病等。药理研究表明其具有免疫抑制活性及抗肿瘤、抗炎等作用，但雷公藤有大毒，应用时须谨慎。雷公藤毒性来源于其复杂的化学成分及生理活性成分，化学成分毒性由大到小大依次为二萜类、生物碱类、三萜类及苷类。雷公藤临床上治疗窗口窄，主要的活性成分如雷公藤甲素、雷公藤红素既是有效成分也是毒性成分。因此，为了临床用药的安全有效，找出雷公藤中有效成分及其有效剂量与中毒剂量的大小至关重要。本文主要从以下几个方面进行研究。
　　 一、雷公藤单体及制剂对HL-7702的细胞毒性研究
　　 雷公藤临床应用的副作用表现为对多系统的损伤，尤其是肝脏系统。HL-7702细胞是正常人肝细胞，是体外研究药物对人肝细胞作用及机制的良好细胞模型。因此，本研究选择该细胞株来寻找雷公藤中的毒性成分。本研究选择的雷公藤单体为前期实验室分离出的8种单体，其中雷公藤二萜有雷公藤甲素与雷酚内酯;雷公藤三萜有雷公藤红素与雷公藤内酯甲;雷公藤碱有雷公藤碱戊、雷公藤晋碱、雷公藤次碱及雷公藤碱。本研究选择的制剂为常用的两种雷公藤制剂，为雷公藤片及雷公藤多苷片。
　　 通过测定细胞增殖抑制率研究雷公藤单体及制剂对HL-7702细胞的毒性效应。8种雷公藤单体及66批雷公藤制剂分别以不同的浓度作用HL-7702细胞24h。MTT比色法测定这些样品对HL-7702细胞的增殖抑制率。
　　 雷公藤单体的实验结果显示:雷公藤碱戊、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤碱及雷酚内酯在200μg/ml范围内对HL-7702细胞增殖没有明显的抑制作用。雷公藤内酯甲在200μg/ml才表现出抑制作用，抑制率为42.36％;雷公藤甲素IC50为199.7μg/ml，且其浓度与细胞抑制率依赖关系不明显，在0.01μg/ml时抑制率就达30％;雷公藤红素IC50为3.56μg/ml。所以可以认为雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤碱戊及雷公藤碱4种生物碱及雷酚内酯对HL-7702细胞没有明显毒性作用，而其余3种单体毒性大小为雷公藤红素、雷公藤甲素、雷公藤内酯甲。
　　 雷公藤制剂的实验结果发现:11家企业的66批雷公藤制剂在低浓度组多数表现为促细胞生长作用（企业6的2批与企业11的1批制剂例外）;在中浓度组时都表现出不同的抑制作用;而在高浓度组多数表现为高强度的抑制作用（企业3与企业10制剂例外），这可能与制剂中某些毒性成分含量有关。
　　 二、雷公藤免疫抑制活性单体筛选
　　 通过体外小鼠脾淋巴细胞转化实验来筛选具有免疫抑制活性的雷公藤单体。8种雷公藤单体及66批雷公藤制剂分别以不同浓度作用经过ConA及LPS体外刺激的小鼠脾淋巴细胞48h，MTT比色法测定雷公藤单体及制剂对刺激后细胞的抑制率。
　　 雷公藤单体的实验结果显示:雷公藤碱戊、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤碱及雷酚内酯在100μg/ml对ConA及LPS刺激下小鼠脾淋巴细胞没有抑制作用，而雷公藤甲素对于ConA及LPS刺激的IC50分别为2.34ng/ml、1.24ng/ml;雷公藤红素对于ConA及LPS刺激的IC50分别为87.43ng/ml、36.10ng/ml;雷公藤内酯甲对于ConA及LPS刺激的IC50分别为1.29mg/ml、0.87mg/ml。提示雷公藤碱戊、雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤碱及雷酚内酯这5种单体没有免疫抑制活性，其余3种单体的免疫抑制活性按大小依次为雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲。
　　 雷公藤制剂的实验结果发显示:11家企业66批雷公藤制剂多数在不同浓度组对刺激后小鼠脾淋巴细胞表现不同的抑制率，不同企业及同一企业不同批次间样品间的抑制作用有差异。
　　 三、雷公藤制剂中雷公藤红素的含量测定
　　 前期实验已经证明了雷公藤红素的免疫抑制活性强，且对HL-7702细胞的毒性也最大，但对于雷公藤红素的含量控制尚未列入雷公藤制剂的质量标准中，所以准确控制雷公藤制剂中雷公藤红素的含量有重要意义。本章采用Welch MltimateTM XB-C18色谱柱，以乙腈-0.1％磷酸(80(∶)20)为流动相，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长425nm，建立高效液相色谱法测定雷公藤片及雷公藤多苷片中雷公藤红素的含量方法。结果表明雷公藤红素在0.472～94.4μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.9999)，雷公藤片及雷公藤多苷片中平均加样回收率（n=9）分别为98.32％(RSD=3.13％)和101.19％(RSD=2.17％)。该方法简单，准确，重复性好，可用于雷公藤制剂中雷公藤红素的含量测定。
　　 四、雷公藤制剂中雷公藤甲素与雷公藤内酯甲的含量测定
　　 前期实验显示雷公藤甲素的免疫抑制活性最强，毒性次于雷公藤红素。雷公藤内酯甲的毒性相对较小，且其有效剂量也偏大。目前雷公藤制剂的质量标准主要是对这2种活性成分含量进行控制。为了评价雷公藤制剂中这2种成分的含量与细胞抑制率的关系，需要对雷公藤制剂中这2种成分含量进行测定。具体实验方法及结果见“2010级杨臣研究生”毕业论文。
　　 五、雷公藤制剂中相关化学成分对HL-7702细胞抑制率的相关分析
　　 雷公藤属于传统的中草药，由于中药化学成分复杂，其治疗作用通常是其化学成分综合作用的结果，同时它的毒性反应也可能是这些化学成分综合作用的结果。为了弄清雷公藤制剂中雷公藤甲素、雷公藤红素及雷公藤内酯甲这3种有效成分与细胞毒性作用的关系，对这3成分含量与细胞抑制率作相关性分析。
　　 结果显示:在低浓度组时，多数制剂表现为促细胞生长作用（企业6的2批与企业11的1批制剂例外）。在中浓度组与高浓度组，各样品都表现为抑制细胞生长，且与细胞抑制率相关最强的是雷公藤内酯甲，其次是雷公藤红素。雷公藤单体的细胞毒性表明雷公藤内酯甲的毒性最小，但在雷公藤制剂中，雷公藤内酯甲的含量却与细胞抑制率最相关。提示在雷公藤制剂中，可能有些成分与雷公藤内酯甲有协同作用，使雷公藤内酯甲对HL-7702细胞的作用更敏感。

目录

声明

中英文缩写对照表

摘要

前言

第一章 雷公藤单体及制剂对HL-7702的细胞毒性研究

1．1 引言

1．2 实验材料与仪器

1．2．1 实验药品

1．2．2 实验细胞及主要试剂

1．2．3 主要仪器

1．3 MTT法最适合条件确定

1．3．1 细胞着壁时间观察

1．3．2 吸收波长的选择

1．3．3 HL-7702细胞生长曲线的绘制

1．3．4 HL-7702细胞接种浓度确定

1．3．5 药物作用时间的确定

1．4 实验部分

1．4．1 主要试剂及实验药品的制备

1．4．2 细胞培养

1．4．3 雷公藤单体对HL-7702细胞毒性实验

1．4．4 雷公藤制剂对HL-7702细胞毒性实验

1．4．5 数据统计处理方法

1．5 实验结果

1．5．1 雷公藤单体对HL-7702细胞的增殖抑制率

1．5．2 雷公藤制剂对HL-7702细胞的增殖抑制率

1．5．3 倒置显微镜观察细胞生长形态

1．6 小结

第二章 雷公藤免疫抑制活性单体筛选

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验药品与试剂

2．3 实验部分

2．3．1 主要试剂及实验药品的制备

2．3．2 雷公藤单体对小鼠脾淋巴T、B转化实验影响

2．3．3 雷公藤单体对小鼠脾淋巴细胞的毒性作用

2．3．4 雷公藤制剂对小鼠脾淋巴T、B转化实验影响

2．3．5 数据统计处理方法

2．4 实验结果

2．4．1 雷公藤单体对小鼠脾淋巴T、B细胞转化实验

2．4．2 雷公藤单体对小鼠脾淋巴细胞的毒性作用

2．4．3 雷公藤制剂对小鼠脾淋巴T、B细胞转化实验

2．4．4 倒置显微镜下观察细胞生长形态

2．5 讨论

2．5．1 超声时间及超声转速的确定

2．5．2 ConA及LPS最佳浓度的确定

2．6 小结

第三章 雷公藤制剂中雷公藤红素的含量测定

3．1 引言

3．2 仪器与试药

3．2．1 仪器

3．2．2 试药

3．3 实验结果及方法学考察

3．3．1 色谱条件

3．3．2 对照品溶液的制备

3．3．3 供试品溶液的制备

3．3．4 线性关系考察

3．3．5 精密度试验

3．3．6 重现性试验

3．3．7 稳定性试验

3．3．8 回收率试验

3．3．9 检测限与定量限

3．3．10 样品测定结果

3．4 讨论

3．4．1 吸收波长的选择

3．4．2 流动相的选择

3．4．3 提取溶剂的考察

3．4．4 提取方式的考察

3．4．5 定容溶剂的考察

3．5 小结

第四章 雷公藤制剂中雷公藤甲素与雷公藤内酯甲的含量测定

第五章 雷公藤制剂中相关化学成分与HL-7702细胞抑制率相关分析

第六章 总结

参考文献

附录A 雷公藤8种单体不同浓度对HL-7702细胞的抑制率

附录B 11加企业66批雷公藤制剂对HL-7702细胞及小鼠脾淋巴细胞作用结果

致谢

综述

作者简历