葛根提取物对激素诱导骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路的调节作用

摘要

目的:
　　 通过观察中药葛根主要有效成分葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的调节作用，从Wnt/β-catenin信号通路探讨其作用机制，为防治激素所致的股骨头缺血性坏死提供理论依据。
　　 方法:
　　 1.采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化SD大鼠BMSCs，并从细胞形态学、生长曲线特点和流式细胞仪检测BMSCs细胞的表面抗原等方面进行鉴定。
　　 2.采用MTT比色法得出葛根素对BMSCs生长的最佳浓度，低剂量组使用1/2最佳浓度，药物中剂量组使用最佳浓度，高剂量组使用2倍最佳浓度。实验共分5组，空白组:含15％胎牛血清的L-DMEM培养基100mL(15％FBS100ml);对照组:15％ FBS100ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松储存液;低剂量组:15％ FBS99.5ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松储存液+0.5ml＊10-3mol/l葛根素储存液;中剂量组:15％ FBS99ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松储存液+1ml＊10-3mol/l葛根素储存液;高剂量组:15％ FBS98ml+0.1ml*10-3mol/l地塞米松储存液+2ml＊10-3mol/l葛根素储存液。
　　 3.上述5组培养6天后，行透射电镜、油红0染色、甘油三酯检测、PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路主要成员Wnt10b、Fz1、GSK3β、β-catenin、TCF4mRNA的表达及脂肪转录因子PPARγmRNA和C/EBPαmRNA的表达、Western blot法对Wnt/β-catenin信号通路的关键因子β-catenin蛋白的表达进行分析等检测。
　　 结果:
　　 1.细胞鉴定:形态学方面:光镜下观察大鼠BMSCs细胞可见其贴壁生长，细胞之间紧密相连，成纤维形或纺锤样，并逐渐融合成片，沿胞体长轴极性排列，集落呈现旋涡状，经过传代纯化后，第三代BMSCs贴壁速度增快，生长迅速，形态单一，呈长梭形，细胞核较大，分布均匀，典型的漩涡状生长，杂细胞较少;MTT法测OD值后绘制生长曲线呈典型的S形，采用流式细胞仪对第三代BMSCs进行细胞表面标志抗原检测结果示:第3代BMSCs的CD45阳性表达率约8.24％，CD90阳性率达99.98％。由此可说明本实验采用的全骨髓贴壁培养法得到的的细胞为BMSCs并且纯度较高。2.油红O染色示:空白组未发现红染的脂肪细胞或颗粒，对照组可见脂肪细胞及较多的红色脂肪颗粒和脂滴，低剂量组可见少量细胞内含脂肪滴及脂肪颗粒，高、中剂量组未见明显的脂肪滴，偶见脂肪颗粒，均明显较低剂量组少。3.电镜观察:空白组细胞形态正常，细胞器数量丰富，胞内未发现脂滴，中剂量组及高剂量组细胞形态基本正常，未见明显脂肪滴，低剂量组细胞核呈圆形或椭圆形，胞内见数量较少的脂肪滴及脂肪颗粒，对照组细胞核退化，细胞内见大量脂肪颗粒及大脂滴。4.甘油三酯检测:对照组比空白组甘油三酯含量明显升高，而葛根素各组比对照组均有明显下降，低剂量组与高、中剂量组相比有差异，高、中剂量组之间比较无明显差异。与对照组比较，葛根素低、中、高剂量组均较对照组明显降低。5.RT-PCR: Wnt10b、β-catenin、TCF4mRNA的表达与空白组比较均有不同程度的明显下调，而在葛根素各干预组则上述指标明显上调，且均有显著性差异;GSK3βmRNA及脂肪转录因子PPARγ、C/EBPαmRNA的表达在对照组均有显著增加，而葛根素各干预组较对照组均有显著降低。6.Western blot:与空白组比较，对照组β-catenin蛋白的表达明显下调，葛根素各干预组较对照组均有不同程度的上升，其中中剂量组对β-catenin蛋白表达促进效果最好;与对照组相比，中、高剂量组则均有非常显著性差异，空白组及低剂量组则有显著性差异。
　　 结论:
　　 1.葛根素干预激素诱导BMSCs的成脂分化后，从油红O染色、电镜观察、细胞内甘油三酯含量检测及PPARγ mRNA、C/EBPαmRNA的表达差异上，提示葛根素可抑制激素诱导下BMSCs的成脂分化。
　　 2.葛根素对激素诱导BMSCs成脂分化的抑制作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号传导通路，调节关键因子Wnt10b、GSK3β、β-catenin、TCF4mRNA的表达来实现的。
　　 3.葛根素对激素诱导BMSCs成脂分化的抑制作用可能与调节Wnt/β-catenin信号通路β-catenin蛋白的表达量有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 SD大鼠BMSCs分离、培养、纯化及鉴定

1 研究目的

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要试剂及仪器

2．3 细胞培养液配制

3 实验方法

3．1 BMSCs体外分离与培养细胞

3．2 BMSCs的传代与纯化

3．3 BMSCs的鉴定

4 结果

5 讨论

第二部分 葛根素干预激素诱导BMSCs成脂分化过程形态学观察及生化指标检测

1 葛根素对BMSCs增殖活性的影响

1．1 实验材料及方法

1．2 结果

1．3 讨论

2 BMSCs分组及药物干预的形态学观察及生化指标检测

2．1 实验材料及方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三部分 葛根素干预激素诱导BMSCs成脂分化过程Wnt／β-catenin信号通路相关基因及脂肪转录因子的表达

1 研究目的

2 实验材料及方法

2．1 主要试剂及仪器

2．2 实验方法与步骤

3 实验结果

4 分析与讨论

第四部分 葛根素干预激素诱导BMSCs成脂分化过程Wnt／β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin的表达

1 研究目的

2 实验材料及方法

2．1 主要试剂及仪器

2．2 实验步骤

3 实验结果

4 讨论

结论

展望

参考文献

附录

致谢

综述

作者简历