核糖体蛋白S3a抑制内毒素诱导的炎症作用及协同商陆皂苷甲抗炎作用的研究

摘要

目的:研究具有抗炎作用的商陆皂苷甲(Esculentoside A，EsA)细胞内结合蛋白核糖体蛋白RPS3a与炎症的关系;并进一步研究商陆皂苷甲的抗炎作用机制及与RPS3a的关系，为炎症相关疾病治疗提供新的思路
　　 方法:应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因，并将RPS3a亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV中，酶切及测序鉴定后，再将含RPS3a基因的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-RPS3a进行PmeⅠ酶线性化处理，转化到含有骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态菌，进行同源重组;将质粒pAd-RPS3a PacⅠ酶切线性化，采用Lipofectamine2000转染到HEK293细胞中进行病毒包装，通过绿色荧光观察病毒包装表达情况，病毒包装成功后用HEK293细胞进行滴度测定。在不同细胞上验证RPS3a的表达，根据相同的MOI加入Ad-RPS3a和Ad-GFP，Western Blot印迹实验鉴定;建立内毒素(LPS)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症模型，ELISA和Griess法检测细胞上清炎症相关介质TNF-α、IL-10和NO的含量，Western Blot检测与细胞因子产生密切相关的NFκB信号通路、MAPK信号通路、AKT信号通路和STAT3信号通路蛋白的含量;LPS建立急性炎症致死性小鼠模型，观察RPS3a高表达对小鼠生存率的影响。
　　 结果:成功克隆出RPS3a目的片段，插入到穿梭质粒pShuttle-CMV重组为pShuttle-CMV-RPS3a，经SalⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和序列测定证明目的片段正确。穿梭质粒pShuttle-CMV-RPS3a在含有骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183细菌内同源重组产生腺病毒质粒pAd-RPS3a，质粒pAd-RPS3a经PacⅠ酶切和PCR鉴定重组成功;将线性化腺病毒重组质粒转染HEK293细胞包装成腺病毒，扩增后滴度可达1011pfu/ml;经Western Blot验证感染AdRPS3a的人胚肾293细胞、NIH3T3细胞、大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞RPS3a蛋白水平表达均升高;RPS3a高表达的巨噬细胞RAW164.7能够显著抑制LPS刺激产生的NO、TNF-α，而升高抗炎因子IL-10含量; Western Blot检测发现RPS3a高表达能抑制LPS诱导升高的p-ERK、p-JNK和p-P38水平;AdRPS3a能抑制LPS刺激升高的p-Iκ B水平，但对LPS诱导降低的Iκ B水平无影响;RPS3a高表达还能激活STAT3信号通路，但对AKT信号通路无影响;体内实验发现RPS3a高表达能够显著延长LPS致死性模型小鼠生存期;EsA与RPS3a协同抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7释放NO。
　　 结论:核糖体蛋白RPS3a的高表达在体内外均具有一定的抗炎作用，其作用机制可能与抑制MAPK和NF-κ B信号通路，激活STAT3通路有关;EsA结合RPS3a是其抑制炎症的重要的分子机制。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 核糖体蛋白RPS3a腺病毒载体的构建和体外表达

1 实验材料与试剂

2 实验方法

2．1 穿梭质粒pShuttle-CMV-RPS3a的构建

2．2 BJ5183细菌内同源重组腺病毒质粒pAdRPS3a

2．3 重组腺病毒pAd-RPS3a的包装

2．4 病毒的扩增与收集

2．5 病毒上清滴度的测定

2．6 Western印迹法检测RPS3a蛋白在不同细胞上的表达

3 实验结果

3．1 RPS3a基因克隆

3．2 穿梭质粒pShuttle-CMV-RPS3a的鉴定

3．3 测序鉴定

3．4 重组腺病毒pAd-RPS3a载体的酶切鉴定及PCR鉴定

3．5 腺病毒Ad-RPS3a和Ad-GFP滴度测定观察

3．6 Western blot鉴定

4 讨论

第二章 核糖体蛋白S3a抑制内毒素诱导的炎症作用及协同商陆皂苷甲抗炎作用的研究

1 实验材料与试剂

2 实验方法

2．1 Ad-RPS3a对LPS刺激RAW264．7细胞释放NO和细胞因子的影响

2．2 Ad-RPS3a对LPS刺激RAW264．7细胞信号通路的影响

2．3 Ad-RPS3a对LPS致死模型小鼠生存期的影响

3 实验结果

3．1 RPS3a对LPS诱导小鼠巨噬细胞系RAW264．7释放NO、TNF-α和IL-10的影响

3．2 RPS3a对LPS诱导的信号通路的影响

3．3 RPS3a对LPS致死性模型小鼠生存率的影响

3．4 EsA与RPS3a协同抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞系RAW264．7释放NO

4 讨论

结论

参考文献

致谢

综述

作者简历