扶正清解方通过线粒体凋亡通路诱导肝癌细胞凋亡的机制研究

摘要

扶正清解方(Fu zheng Qing jierecipe，FZQJ)为全国名老中医杜建教授临床使用的经验方，现已经成为福建省第二人民医院的院内制剂，即芪黄扶正清解颗粒。本方虽然已经经临床应用证明能加强化疗的疗效，但其作用机制仍待深入研究。本文通过体外使用扶正清解方干预多种肿瘤细胞来探讨扶正清解方对多种肿瘤细胞的增殖率的影响，并特别针对肝癌细胞株HepG2，通过线粒体介导的凋亡通路，研究扶正清解方的抗肿瘤作用机制，同时通过H22移植ICR小鼠实验研究其在体内抗肿瘤的作用。
　　体外研究中，MTT检测结果发现扶正清解方水提取液可不同程度的抑制人AGS胃癌细胞、HT-29结肠癌细胞、Hela宫颈癌细胞以及HepG2肝癌细胞的生长。为了阐述扶正清解方抑制HepG2的作用机制，本文通过流式细胞仪检测其凋亡，结果发现随给药浓度的增加凋亡率增加，当药物浓度达到2mg/mL时，凋亡率达到30.93％。采用DAPI染色观察发现给药组的细胞核固缩，染色加深，染色质聚集或碎裂。并随着药物浓度的加大，现象越明显，表明药物对细胞凋亡的诱导具有浓度依赖性。采用JC-1法检测HepG2细胞的线粒体膜电位的变化，发现给药浓度1～2mg/mL范围内，细胞线粒体膜电位显著性下降(P＜0.05)，并且呈现浓度依赖性。采用RT-PCR与Westernblot检测线粒体相关基因Bcl-2、Bax的表达，结果发现Bcl-2的表达随着给药浓度的增加而减弱，而Bax的表达随给药浓度增大而增强。对Caspase-3与Caspase-9蛋白的活性进行检测，发现随着药物浓度的增加，Caspase-3、Caspase-9的活性增加，且在1～2mg/mL药物浓度范围内，显著性增加（P＜0.05）。
　　体内研究中，我们采用扶正清解方提取液干预H22荷瘤小鼠，发现扶正清解组的平均瘤重为0.53±0.12g，对照组的平均瘤重为1.18±0.48g，两组之间瘤重有显著性差异（P＜0.05)。说明扶正清解方能够抑制H22荷瘤小鼠腋下肿瘤的生长。病理切片结果显示:扶正清解组肿瘤细胞发生核皱缩，胞浆肿胀等细胞凋亡的特征。TUNEL法测凋亡结果显示，扶正清解方组的瘤体凋亡细胞数量明显增多。RT-PCR检测结果显示FZQJ组Bcl-2基因的表达减弱，Bax基因表达增强。通过Westernblot检测Bcl-2、Bax蛋白的表达，结果与RT-PCR的检测结果相符。提示扶正清解方在体内也是通过下调Bcl-2、上调Bax而发挥体内诱导肿瘤凋亡的作用。
　　本研究结果表明，扶正清解方能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，能够诱导肝癌细胞凋亡，体内外的研究皆表明，其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制与启动线粒体凋亡通路有关。

目录

声明

摘要

前言

第一章 扶正清解方对不同肿瘤细胞增殖的影响

1 材料

1．1 细胞系

1．2 药物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 常用试剂的配制

2 方法

2．1 细胞培养

2．1．1 细胞的传代培养

2．1．2 细胞的冻存与复苏

2．2 MTT法检测扶正清解方对不同肿瘤细胞增殖的作用

2．3 统计学分析

3 结果

3．1 FZQJ抑制HepG2细胞的生长

3．2 FZQJ抑制AGS细胞的生长

3．3 FZQJ抑制Hela细胞的生长

3．4 FZQJ抑制HT-29细胞的生长

4 讨论

5 小结

第二章 基于线粒体通路扶正清解方诱导肝癌细胞HepG2凋亡的机制研究

1 材料

1．1 细胞系

1．2 药物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 常用试剂配制

2 方法

2．1 细胞培养

2．2 倒置显微镜观察细胞形态变化

2．3 DAPI染色法检测细胞凋亡

2．4 Annexin V-FITC检测细胞凋亡

2．5 JC-1检测线粒体膜电位的变化

2．6 RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因表达

2．7 Western blot检测Bel-2、Bax蛋白表达

2．8 Caspase 9、Caspase 3活性检测

2．9 统计学分析

3 结果

3．1 HepG2形态变化

3．2 DAPI染色

3．3 凋亡率的变化

3．4 线粒体膜电位变化

3．5 Bcl-2和Bax基因表达情况

3．6 Bcl-2和Bax蛋白表达情况

3．7 Caspase-9和Caspase-3活性变化

4 讨论

5 小结

第三章 扶正清解方对H22皮下移植瘤生长和凋亡的影响

1 材料

1．1 药物

1．2 动物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 常规溶液配制

2 方法

2．1 动物模型建立

2．2 实验动物分组及给药

2．3 取材

2．4 病理切片HE染色

2．5 TUNEL法测肿瘤组织凋亡

2．6 RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因

2．7 Western blot检测

2．8 统计方法

3 结果

3．1 扶正清解方对肿瘤及小鼠体重的影响

3．2 HE染色结果

3．3 TUNEL检测结果

3．4 肿瘤组织中Bel-2和Bax基因表达变化

3．5 肿瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白表达变化

4 讨论

第四章 研究总结

参考文献

附录

致谢

文献综述 益气养阴中药抗肿瘤研究进展

作者简历