彝药凉山虫草的生药与基于DNA条形码的分析鉴定研究

摘要

近年来，国家对民族医药的重视日益升温，积极推动了具有中国特色的民族药的发展。彝族医药以其独有的诊断治疗技术、独特的用药和良好的疗效，一直延续至今。在国家政策的号召和支持下，并经过广大民族医药工作者长期深入实地考察、发掘整理古籍文献，使彝族医药在实验室研究以及临床应用方面都取得了突破性进展。因此在肯定了彝药具有巨大潜在价值的同时，也使彝药的发展迎来了新的契机。 彝药“木谷补底”，学名凉山虫草，为麦角菌科真菌凉山虫草菌（Metacordycepsliangshanensis）寄生在鳞翅目幼虫上的子座及幼虫尸体的干燥复合体，习称“麦秆虫草”，为中国特有种。以四川、云南、贵州等省区为主产区，在1987年版《四川省中药材标准》（增补本）收载了凉山虫草。 目的: 随着虫草资源的锐减，有力替代资源的凉山虫草受到了较大的关注。但由于凉山虫草的研究起步较晚，不够深入。地方标准表述较为简单，以外观性状和显微鉴别为主，不足以客观评价其质量。特别是随着虫草入药以及作为保健品逐步产业化，大多以破碎性药材或粉末入药。为了解决地方标准中检查项单一和破碎性药材检验困难两大问题，课题对凉山虫草进行了生药和基于DNA条形码的分析鉴定研究。 方法: 本课题通过实地采集、调查研究和标本整理，收集到来源准确的凉山虫革。在生药部分应用性状和显微鉴定法对凉山虫草及其混伪品进行了详细的鉴别研究。在此基础上，通过DNA条形码分析研究，分别对凉山虫草来源真菌和寄主昆虫进行基因组提取，对其目的基因片段进行PCR扩增，序列测定。并通过DNA条形码数据分析，表明DNA条形码技术用于虫草属特种间的区分鉴别切实可行，且不受发育阶段及器官组织特异的影响，结果准确可靠。 结果: 1、通过对8批凉山虫草样品及2批混伪品的性状和显微观察，在地方标准及相关文献性状描述的基础上，结合药材自身特征，着重从虫体部位入手，对虫体内部菌丝进行了探索，补充了凉山虫草虫体与子座横、纵向切片及粉末切片的特征，为地方标准中凉山虫草的检查鉴别提供了有益的参考。 2、对已进行生药学鉴定的样本进行了分子生物学研究: (1)首次应用分子生物学方法对凉山虫草进行分析研究，将ITS序列、COI序列、Cytb序列分别对虫草的寄生真菌和寄主昆虫进行DNA条形码研究，将凉山虫草与近缘物种及其混伪品区分开来。 (2)利用ITS序列分别对凉山虫草、冬虫夏草、亚香棒虫草、戴氏虫草的寄生真菌进行亲缘关系及系统发育研究:从NJ树上看到，凉山虫草与冬虫夏草寄生真菌的遗传距离较近，戴氏虫草与亚香棒虫草寄生真菌的遗传距离较近。 (3)通过基于COI序列和Cytb序列对虫草寄主昆虫进行DNA条形码研究分析，对其序列适用性进行探讨，结果表明COI序列更适用于虫草寄主昆虫的DNA条形码研究。 (4)首次将COI序列和Cytb序列结合探讨虫革寄主昆虫的亲缘关系及系统发育地位，通过基于两种基因序列所构建的NJ树中可以看出，两个基因片段的系统发育的进化树归属趋向一致。并且可以看出，亚、戴氏虫草寄主与凉山虫草寄主属于平行进化，且这一混杂的支系位于进化树的顶端，进化较晚，而冬虫夏草是比其他物种较早分化种。 结论: 本研究首先对凉山虫草的性状和显微特征进行了详细的研究，通过与混淆品的比较，确证了这些特征的专属性，证明其研究结果具有普遍的实际意义和应用价值;并且通过本课题的研究，初步建立了基于DNA条形码对凉山虫草进行鉴定的方法，结果准确、简便易行，为凉山虫草的质量客观评价及标准提升提供了技术支持，也为建立破碎药材的分析检验和客观评价标准做了有益的初探。同时，为分子生物学技术在中药分析和鉴定中的应用提供依据具有较强的实际意义。但目前关于虫草寄主昆虫的分子生物学研究还很少，有待广泛采集来源准确的样本，进一步积累数据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 本草考证与文献综述

第一节 凉山虫草的本草考证

第二节 凉山虫草的现代研究进展

1 凉山虫草的基原

2 凉山虫草与冬虫夏草化学成分比较

3 药理作用研究概况

第三节 DNA条形码技术在中药分析鉴定方面的运用

1 DNA条形码技术

2 DNA barcoding在中药材分析鉴定中的优势

3 ITS序列在虫草真菌研究中的应用

4 COI序列在昆虫研究中的应用

5 Cytb序列在动物研究中的应用

第二章 凉山虫草的生药学鉴定

第一节 药源调查和基原鉴定

第二节 凉山虫草性状鉴别和显微研究

1 实验仪器与试药

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三节 混伪品的性状鉴别和显微研究

1 实验仪器和试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

第三章 基于DNA条形码对于凉山虫草的分析鉴定研究

第一节 DNA条形码分子鉴定分析方法的确立

1 实验仪器与试药

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二节 基于ITS序列和COI序列对凉山虫草和近缘物种及其混伪品的分子鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三节 线粒体COI和CYTB基因在虫草物种寄主昆虫鉴定中的适用性分析

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

总结

参考文献

致谢

文献综述 浅谈对彝族动物药发展的认识

附录

攻读硕士学位期间发表论文

作者简历