活血通督汤促进兔脊髓缺血再灌注损伤修复的作用及机制

摘要

目的：
　　通过夹闭腰动脉法建立合适的兔SCⅡ模型，探索合适的夹闭时限，用活血通督汤进行干预，观察活血通督汤对兔SCⅡ后肢功能的影响，研究其对脊髓组织TNF-a、IL-1β、IL-8及BDNF、Slit2、GFAP表达和神经元凋亡的影响，探讨活血通督汤治疗SCⅡ的作用和机制。
　　方法：
　　1.不同夹闭时限建立兔脊髓缺血再灌注损伤腰动脉模型的比较研究
　　将24只新西兰大白兔随机分为3组:C20组、C30组、C40组，每组各8只。C20组、C30组、C40组分别阻断第3-6腰动脉20min、30min、40min来建立兔SCⅡ模型。再灌注后12h、24h、48h采用Jacobs法对兔后肢运动功能进行评估，并计算截瘫率。最后一次评分后，取出L2-L6节段脊髓，通过HE染色进行病理观察，计数正常神经元的数目。
　　2.活血通督汤对兔脊髓缺血再灌注损伤后肢运动功能的影响
　　将16只新西兰大白兔随机分为2组:模型组和活血通督汤组，每组各8只。模型组和活血通督汤组采用夹闭第3-6腰动脉30min来建立兔SCⅡ模型。活血通督汤组术前7天和后术21天予以活血通督汤灌胃，模型组予以等量生理盐水灌胃。于再灌注后1d、3d、7d、14d、21d分别观察各组兔后肢功能，并参照Jacobs法和BBB法对各组兔后肢运动功能进行评定。
　　3.活血通督汤治疗兔脊髓缺血再灌注损伤的机制
　　136只新西兰兔随机分为3组:假手术组8只，模型组64只（分为再灌注0.5h、1h、4h、8h、1d、3d、7d、14d等8个亚组，每组各8只）和活血通督汤组64只（分为再灌注0.5h、1h、4h、8h、1d、3d、7d、14d等8个亚组，每组各8只）。活血通督汤组兔术前7天和术后予以活血通督汤灌胃，模型组兔术前7天和术后予以等量生理盐水灌胃。采用ELISA法检测脊髓组织TNF-a、IL-1β、IL-8、BDNF、Slit2、GFAP的表达，免疫组化法检测脊髓组织TNF-a和GFAP的表达，TUNEL法检测脊髓神经元凋亡。
　　结果：
　　1.不同夹闭时限建立兔脊髓缺血再灌注损伤腰动脉模型的比较研究
　　1.1 Jacobs法评级:C20组、C30组、C40组的Jacobs法评级在12h、24h、48h互相比较均有显著性差异（均为P＜0.01）。C20组在12h、24h和48h均优于C30组和C30组（均为P＜0.01）。C30组与C40组在12h、24h、48h互相比较均无显著性差异(均为P＞0.05)。
　　1.2 截瘫率:C20组、C30组、C40组的截瘫率分别为0％、75％和87.5％。C20组截瘫率优于C30组和C40组(P＜0.05)，C30组和C40组相比较无显著性差异(P＞0.05)。
　　1.3 HE染色病理学观察:C20组脊髓组织形态较完整，轻度肿胀，组织间有出血点，脊髓前角神经元数目较多，神经元胞体较大，核仁、核膜清晰，胞体内可见丰富噬碱性染色颗粒。C30与C40组有不同程度的病理损伤，主要表现为:脊髓组织肿胀，可见出血点，脊髓前角神经元数目减少，神经元周围间隙增大呈空泡状，神经元胞体固缩，细胞核深染，核膜、核仁不清晰甚至消失，胞质内噬碱性染色颗粒不明显。
　　1.4 脊髓前角正常神经元的计数:C20组＞C30组＞C40组，三组两两比较有显著性差异(P＜0.05)。
　　2.活血通督汤对兔脊髓缺血再灌注损伤后肢运动功能的影响
　　2.1 Jacobs评级:模型组和活血通督汤组Jacobs评级结果从1d至21d逐渐增高。活血通督汤组兔Jacobs评级结果在7d、14d、21d均优于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.2 BBB法评分:模型组和活血通督汤组兔BBB法评分结果从1d至21d逐渐增高。活血通督汤组兔BBB法评分优于模型组相比较，在3d、7d、14d具有显著性差异(P＜0.05)，在21d具有非常显著性差异(P＜0.01)。
　　3.活血通督汤治疗兔脊髓缺血再灌注损伤的机制
　　3.1 ELISA法:
　　3.1.1 TNF-a、IL-1β、IL-8的表达:与假手术组相比较，模型组脊髓组织TNF-a、IL-1 B、IL-8的表达在0.5h、1h、4h、8h显著增高（0.5h、1h、4h、8h均为P＜0.01）;活血通督汤组脊髓组织TNF-a、IL-1β、IL-8表达与模型组相比在0.5h、1h、4h、8h显著减少，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3.1.2 BDNF、Slit2、GFAP的表达:与假手术组相比较，模型组脊髓组织BDNF、Slit2、GFAP的表达在1d、3d、7d、14d显著增高（P＜0.05或P＜0.01）;活血通督汤组脊髓组织BDNF、Slit2的表达与模型组组相比在1d、3d、7d、14d显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），GFAP的表达在3d、7d、14d显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.2 免疫组化法:
　　3.2.1 TNF-a的表达:假手术组脊髓组织未见明显的棕黄色染色神经元;模型组和活血通督汤组均可见脊髓前角神经元及部分胶质细胞呈棕黄色染色。与假手术组相比较，模型组吸光度值在0.5h、1h、4h、8h显均著增高，差异具有统计学意义(0.5h、1h、4h、8h均为P＜0.01);活血通督汤组与假手术组相比较在0.5h、1h、4h、8h显著增高，差异具有统计学意义（0.5h、1h、4h、8h均为P＜0.01），与模型组相比较在0.5h、1h、4h、8h均有显著降低，差异具有统计学意义(0.5h为P＜0.05，1h、4h、8h均为P＜0.01)。
　　3.2.2 BDNF的表达:假手术组脊髓组织未见明显的棕黄色染色神经元;模型组和活血通督汤组均可见脊髓组织内有较多明显呈棕黄色染色的神经元及胶质细胞。与假手术组相比较，模型组吸光度值在1d、3d、7d、14d显均著增高，差异具有统计学意义(1d、3d、7d、14d均为P＜0.01);活血通督汤组吸光度值与假手术组相比较在1d、3d、7d、14d显著增高，差异具有统计学意义（1d、3d、7d、14d均为P＜0.01），与模型组相比较在1d、3d、7d、14d均有显著增高，差异具有统计学意义(3d为P＜0.05，1d、7d、14d均为P＜0.01)。
　　3.3 TUNEL法:凋亡的神经元深染，呈棕黄色。假手术组凋亡细胞较少;模型组各和活血通督汤可见凋亡神经元。与假手术组相比较，模型组凋亡指数在4h、8h、1d、3d显均著增高，差异具有统计学意义（4h、8h、1d、3d均为P＜0.01），其中1d组最高;活血通督汤组凋亡指数与假手术组相比较在4h、8h、1d、3d显著增高，差异具有统计学意义（4h、8h、1d、3d均为P＜0.01），与模型组相比较在4h、8h、1d、3d均有显著降低，差异具有统计学意义(4h为P＜0.05，8h、1d、3d为P＜0.01)。
　　结论：
　　1.夹闭第3-6腰动脉30min可导致脊髓部分不可逆性损伤，可用于建立兔SCⅡ模型。
　　2.活血通督汤具有改善兔SCⅡ后肢运动功能的作用，对SCⅡ起到一定的治疗作用，其可能的作用机制为抑制炎性反应，减轻神经元凋亡，改善脊髓神经修复环境。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

第一部分 不同夹闭时限建立脊髓缺血再灌注损伤腰动脉模型的比较研究

1．研究目的

2．实验材料

2．1 实验动物

2．2 实验试剂及药品

2．3 实验仪器

3．实验方法

3．1 实验动物分组

3．2 建立动物模型

3．3 后肢功能评定

3．4 脊髓取材

3．5 HE染色

3．6 尼氏染色

3．7 病理学观察及正常神经元计数

3．8 数据统计

4．实验结果

4．1 造模情况

4．2 后肢功能观察

4．3 截瘫率

4．4 病理学观察

4．5 正常神经元计数

4．6 尼氏染色

5．讨论

6．小结

第二部分 活血通督汤对兔脊髓缺血再灌注损伤后肢功能的影响

1．研究目的

2．实验材料

2．1 实验动物

3．实验方法

3．1 活血通督汤的制备

3．2 实验动物分组

3．3 实验动物给药

3．4 建立动物模型

3．5 后肢功能观察

3．6 数据统计

4．实验结果

4．1 造模情况

4．2 后肢功能观察

5．讨论

6．小结

第三部分 活血通督汤治疗兔脊髓缺血再灌注损伤的机制

1．研究目的

2．实验材料

2．1 实验动物

2．2 实验试剂及药品

2．3 实验仪器

3．实验方法

3．1 活血通督汤的制备

3．2 实验动物分组

3．3 实验动物给药

3．4 建立动物模型

3．5 脊髓取材

3．6 ELISA法检测脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-β、BDNF、Slit2、GFAP

3．7 免疫组化法检测脊髓组织TNF-α、BDNF

3．8 TUNEL法检测凋亡神经细胞

3．9 数据统计

4．实验结果

4．1 造模情况

4．2 ELISA检测结果

4．3 免疫组化结果

4．4 TUNEL检测结果

5．讨论

6．小结

总结与结论

参考文献

致谢

文献综述

作者简历