心水通复方水提物对缺氧诱导心肌细胞AQPs影响的研究

摘要

目的:
　　通过借助体外细胞，研究心水通复方水提物对AQPs基因、蛋白表达与细胞线粒体和病理形态变化之间的关系，试图揭示该组方防治CHF的作用机制。
　　方法:
　　通过体外缺氧再复氧诱导人心肌细胞，不同浓度心水通复方水提物干预人心肌细胞。运用MTT法、流式细胞术、激光共聚焦、细胞特殊染色、Real-time PCR、细胞免疫组织化学法和Western blot法，检测细胞活性、细胞损伤和线粒体的变化，以及AQP-1、4、7基因和蛋白的表达之间的关系。
　　结果:
　　1、MTT法结果显示，与模型组相比心水通复方水提物干预组中XST-200和XST-400组的细胞存活率高于模型组，具有显著性差异(p＜0.05）。
　　2、流式细胞术检测线粒体膜电位变化及激光共聚焦观察JC-1染色结果显示，模型组细胞线粒体膜电位明显降低，与正常组相比有显著性差异(P＜0.05）。心水通复方水提物组中XST-400组线粒体膜电位高于模型组且有显著性差异（P＜0.05）。
　　3、Lysotracker Red染色结果显示，模型组溶酶体红色光比值明显降低，与正常组相比有显著性差异(P＜0.05)。心水通复方水提物组中XST-400与XST-600组红色光比值均高于模型组，与模型组相比均有显著性差异（P＜0.05）。
　　4、Real-time PCR结果显示，缺氧再复氧人心肌细胞模型组AQP-1、4、7mRNA表达比正常组显著增高（P＜0.05）。在心水通复方水提物200μg/ml～600μ g/ml范围内，AQP-1mRNA的表达水平随着浓度增加而增高;而在XST-400μg/ml，AQP-4、7mRNA的表达明显比200μ g/ml和600μg/ml降低(P＜0.05)，其原因有待进一步研究。
　　5、细胞免疫组织化学结果显示，在人心肌细胞中均可以检测到AQP-1、4、7蛋白的表达。经过缺氧再复氧人心肌细胞模型组中AQP-1、4、7蛋白表达上调，模型组阳性细胞较正常对照组增多，且模型组积分光密度高于正常对照组（P＜0.05）。在心水通水提物XST-200和XST-400干预组中，AQP-1的阳性细胞数比模型组少，其积分光密度比模型组低(P＜0.05）。提示:XST在浓度为200-400μg/ml能够显著下调缺氧诱导心肌细胞的AQP-1蛋白表达(P＜0.05)。而XST-400干预组的AQP-4、7的阳性细胞数量与积分光密度比模型组的阳性细胞减少。说明XST400μg/ml能够显著下调缺氧诱导心肌细胞AQP-4、7蛋白的表达（P＜0.05）。
　　6、Western blot结果显示，缺氧再复氧人心肌细胞模型组中AQP-1、4、7蛋白的表达均上调。心水通水提物能剂量依赖性地上调缺氧再复氧人心肌细胞AQP-1的表达，XST-600μg/ml能将AQP-1的蛋白表达恢复到接近正常对照组水平。XST-400组能够显著下调AQP-4、7蛋白的表达（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.心水通复方水提物能提高缺氧诱导人心肌细胞的耐受，能增强细胞的存活率，对缺氧诱导细胞具有较好的保护作用;
　　2.心水通复方水提物通过稳定线粒体膜电位和稳定溶酶体，减缓线粒体氧化应激性损伤和维持溶酶体酶的活性，可能是保护心肌细胞缺氧再复氧性损伤的机制之一;
　　3.人心肌细胞经过缺氧再复氧后AQP-1、4、7基因与蛋白表达上调;
　　4.心水通复方水提物不同浓度干预缺氧再复氧人心肌细胞，对AQP-1、4、7基因和蛋白表达均有不同影响。AQP-1呈剂量依赖性增高，而AQP-4、7的表达与药物剂量没有相关性，可能的原因与AQP-4、7的功能结构与AQP-1不同，具体原因有待进一步研究。

目录

声明

摘要

前言

第一章 心水通复方水提物对缺氧／复氧心肌细胞存活率、线粒体膜电位和溶酶体变化的研究

1 材料

1．1 细胞种类及来源

1．2 药物

1．3 试剂

1．4 仪器

1．5 试剂配制

2 方法

2．1 心水通复方水提物制备

2．2 实验方法分组及细胞病理模型的构造

2．3 细胞复苏与培养

2．4 细胞传代

2．5 细胞冻存

2．6 MTT法检测细胞存活率

2．7 线粒体膜电位检测

2．8 JC-1染色

2．9 溶酶体染色(Lysotracker Red)

2．10 统计学分析

3 结果

3．1 MTT法检测细胞存活率

3．2 线粒体膜电位检测

3．3 JC-1染色

3．4 溶酶体染色(Lysotraeker Red)

4 讨论

5 结论

第二章 心水通复方水提物对缺氧／复氧心肌细胞AQP-1、4、7基因和蛋白表达的影响

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 常用溶液配制

2．2 Real-time PCR检测AQP-1、4、7基因表达

2．3 细胞免疫组织化学法检测AQP-1、4、7蛋白表达

2．4 Western Blot法检测AQP-1、4、7蛋白表达

2．5 统计学分析

3 结果

3．1 Real-time PCR检测AQP-1、4、7基因表达

3．2 细胞免疫组织化学法检测AQP-1、4、7蛋白表达

3．3 Western Blot法检测AQP-1、4、7蛋白表达

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

文献综述 水通道蛋白与心脏疾病相关性研究进展

作者简历