缺氧条件下血府逐瘀汤影响EphB4/EphrinB2信号促血管新生的实验研究

摘要

目的:
　　以人微血管内皮细胞株HMEC-1为研究对象，探讨缺氧条件下血府逐瘀汤含药血清不同浓度(1.25％，2.5％，5％)与血管新生活动中EphrinB2和EphB4的关系。从细胞水平、分子水平探讨血府逐瘀汤对EphB4/EphrinB2信号的影响，从而为血府逐瘀汤调控血管新生的机制和临床应用提供实验佐证。
　　方法:
　　1.制备大鼠血府逐瘀汤含药血清和空白血清。SPF级SD雄性大鼠60只，体重(230±10)g，随机分为药物组和空白对照组2组，每组30只，由校实验动物中心饲养。参照人和动物间用药剂量的换算，药物组以人口服剂量12倍，即0.41 g/kg灌胃，生理盐水组以等量生理盐水灌胃，血府逐瘀胶囊按剂量溶于生理盐水中，连续灌胃7天，2次/天，于第8天灌胃后两小时注射戊巴比妥钠（2％浓度，0.75 ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，4000r/min离心30min后分离血清，56℃，30min水浴灭活，无菌室超净工作台上用0.22μm的针式过滤器过滤除菌，分装，置于-20℃冰箱保存备用。
　　2.常规培养HMEC-1细胞。将11.6g MCDB-131干粉培养基和1.18g碳酸氢钠完全溶解于超纯水中，定容到1000ml，调整pH值到7.2-7.4，4℃冰箱过夜，次日过滤除菌，分装备用。在配制好的培养基原液中按比例加入EGF，氢化可的松和胎牛血清，配制成完全培养基（MCDB-131培养液、EGF、氢化可的松、胎牛血清按88∶1∶1∶10比例配置），4℃保存备用。在培养基原液中加入胎牛血清制成浓度5％的实验用培基，实验中用于配制不同浓度(1.25％、2.5％、5％)的含药血清。
　　3.管腔形成实验。同血清含量的药物组和空白组缺氧培氧箱（O2浓度1％）培养24h、48h和72h后，将细胞培养皿取出，将细胞用胰酶消化下来，根据实验需要计数，按一定密度稀释并接种于预制的基质胶上，继续培养5小时，倒置显微镜高倍镜下(200×)随机选取视野拍照，计算管腔形成数量，统计学比较相同血清含量条件下药物组和空白组的差异。
　　4.实时荧光定量PCR技术检测EphB4和EphrinB2基因的转录。Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA。根据Genbank发布的基因序列，应用Primer5软件设计靶基因和β-actin的引物。检测不同时间点基因表达情况，用2-△△CT相对定量法进行评价。
　　5.免疫印迹法检测EphB4/EphrinB2和磷酸化Ephrin32的表达。提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度确定蛋白上样量。对提取的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，湿转法将蛋白印迹到PVDF膜上。封闭液封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育并检测条带，比较表达差异。
　　结果:
　　1.管腔形成实验:与相同血清含量的空白血清组比较，24 h作用时间段2.5％和5％含药血清浓度表现为促进血管形成作用，48 h作用时间段只有5％含药血清组对管腔的形成数量起到促进作用。而72 h三个浓度含药血清组对管腔形成均无促进作用。
　　2.实时荧光定量PCR:选取浓度为2.5％的含药血清组干预6h、12h、24h、48h，EphrinB2在含药血清干预6h、12h后皆上调表达(P＜0.01)，EphB4在干预12h后下调表达。而继续干预24h和48h后，基因转录水平与同等血清含量空白血清组比较，二者都没有统计学差异。
　　3.Western Blot蛋白印迹:含药血清组EphrinB2蛋白表达量在9h和24h明显高于空白对照组(P＜0.05)。EphB4蛋白表达量在12h低于空白对照组(P＜0.05)。EphrinB2磷酸化蛋白24h上调表达(P＜0.01)。
　　结论:
　　缺氧条件下血府逐瘀汤具有显著的促血管新生作用，该作用过程与EphB4/EphrinB2信号通路有关。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

实验内容

1 实验材料

1．1 细胞株来源

1．2 实验药物

1．3 主要耗材和试剂

1．4 主要实验仪器和设备

2 实验方法

2．1 含药血清的制备

2．2 细胞的常规培养

2．3 管腔形成实验

2．4 实时荧光定量PCR

2．5 蛋白免疫印迹

2．6 数据分析

实验结果

1 管腔形成实验结果

2 血府逐瘀汤对EphB4／EphrinB2的影响

2．1 血府逐瘀汤对EphB4／EphrinB2基因转录的影响

2．2 缺氧条件下血府逐瘀汤对EphrinB2蛋白表达水平的影响

2．3 缺氧条件下血府逐瘀汤对EphB4蛋白水平的影响

2．4 缺氧条件下血府逐瘀汤对EphrinB2蛋白磷酸化水平的影响

讨论与分析

1 EphB4／EphrinB2信号通路与血管新生

2 缺氧条件下血府逐瘀汤促进血管新生

3 血府逐瘀汤对EphB4／EphrinB2信号的影响

结论

参考文献

致谢

文献综述 缺氧诱导血管新生的相关机制研究进展

作者简介