趋化因子CXCL9/10/11在人肾小球系膜细胞上的表达及在狼疮肾炎诊断中的意义

摘要

目的:探讨干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）对体外培养的人肾小球系膜细胞(Human mesangial cells，HMC)表达趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的影响及其可能的机制;同时研究CXCL9、CXCL10和CXCL11在狼疮肾炎(Lupus nephritis，LN)诊断中的价值，为寻求无创性的高灵敏性肾脏损伤诊断指标奠定理论基础。
　　方法:1、将常规培养的HMC随机分为空白组、IFN-γ刺激组（刺激组）和AG490干预组（干预组）。应用不同浓度的IFN-γ分别刺激HMC6h和48h，应用最佳浓度(1000U/ml)的IFN-γ刺激HMC不同时间，应用JAK2的特异性拮抗剂AG490对IFN-γ的诱导进行干预。用Real-Time PCR检测各组细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11mRNA的表达水平，用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组细胞培养上清液中CXCL9、CXCL10及CXCL11的蛋白表达量;用蛋白印迹法(Western blot)检测空白组、刺激组和干预组中JAK/STAT1信号通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1及其磷酸化蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1的表达量。
　　2、收集31例2015年6月-2015年12月在福建中医药大学附属人民医院风湿科、内分泌科和肾内科住院或门诊就诊的SLE患者（包括LN组和无肾炎组）作为病例组，并选取20例本院体检中心健康体检者作为健康对照组。用ELISA检测病例组和健康对照组外周静脉血及尿液CXCL9、CXCL10和CXCL11的浓度，并分析其与系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)、抗dsDNA抗体、补体C3、C4和尿微量白蛋白(microalbuminuria，mAlb)等指标之间的相关性。
　　结果:1、基础研究表明:
　　(1)随着IFN-γ浓度的增加，HMC表达CXCL9、CXCL10和CXCL11水平增高。当IFN-γ浓度为1000U/ml时，这三个趋化因子的mRNA和蛋白表达量达到最高(P＜0.01或P＜0.05);应用1000U/ml IFN-γ刺激HMC，随着刺激时间的延长，三个趋化因子的mRNA相对表达量均在24h时达到高峰(P＜0.01或P＜0.05); CXCL9、CXCL10的蛋白分泌量在48h时达到高峰(P＜0.01和P＜0.05); CXCL11的蛋白分泌量在72h时达到高峰(P＜0.01)。
　　(2)经AG490预处理后，HMC三个趋化因子mRNA相对表达量与刺激组相比分别下降了98.43％、99.27％和99.29％(P均＜0.01);蛋白分泌量分别下降了80.67％、49.89％和81.50％（P均＜0.01）。
　　(3) HMC经IFN-γ刺激后，细胞内JAK1、JAK2、STAT1的磷酸化水平升高(P均＜0.01);应用AG490干预后，HMC中JAK1、JAK2、STAT1的磷酸化水平与刺激组相比显著减低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　2、临床研究表明:
　　(1) SLE患者血清CXCL9、CXCL10、CXCL11水平均较健康对照组显著升高（P均＜0.01），且分别与抗dsDNA抗体、SLEDAI评分呈正相关(P＜0.01或P＜0.05);其中LN组血清CXCL9、CXCL10、CXCL11水平均较健康对照组显著升高(P均＜0.01），并且LN组血清CXCL9、CXCL10、CXCL11水平虽较无肾炎组增高但无显著性差异（P均＞0.05）。
　　(2) SLE患者尿CXCL9水平与健康对照组间相比无明显差别(P＞0.05)，但尿CXCL10（P＜0.01）、CXCL11(P＜0.05)水平均较健康对照组升高;其中尿CXCL9、CXCL11水平在LN组、无肾炎组及健康对照组间差异均无统计学意义(P均＞0.05）;但LN组、无肾炎组的尿CXCL10水平均较健康对照组显著升高(P均＜0.01），且LN组的尿CXCL10水平较无肾炎组有增高趋势但差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　(3)SLE患者尿CXCL10水平与尿微量白蛋白(mAlb)未呈明显的相关性(r=0.077，P＞0.05);但ROC曲线分析显示:尿CXCL10与mAlb一样对LN具有辅助诊断价值。当mAlb≥62.3mg/mmol·Cre，曲线下面积为0.758(95％ CI:0.589～0.928，P＜0.05);当尿CXCL10≥5.82 ng/mmol·Cre，曲线下面积为0.717(95％ CI0.528～0.905，P＜0.05)。
　　结论:1、IFN-γ可以诱导HMC表达趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11增高，其机制与IFN-γ介导的JAK/STAT1信号通路的激活有关。应用JAK/STAT1信号通路的特异性拮抗剂AG490可以抑制HMC趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达。
　　2、SLE患者血清CXCL9、CXCL10、CXCL11水平及尿液CXCL10、CXCL11水平均较健康对照组升高，说明这三个趋化因子可能参与了SLE的发生发展过程;其中LN患者尿CXCL10较健康对照组升高，且较无肾炎组呈现增高趋势，提示CXCL10可能参与SLE的肾损害，是LN的一个重要的致病因素。监测SLE患者体内趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11水平的变化对辅助诊断SLE肾脏损害、病情评估及预后判断可能具有一定的价值。

目录

声明

摘要

前言

IFN-γ激活JAK／STAT1信号通路上调人肾小球系膜细胞CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达

1 实验材料

1．1 实验细胞

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂及耗材

1．4 主要试剂配制

2 实验方法

2．1 HMC细胞的培养

2．2 Real-Time PCR

2．3 ELISA实验

2．4 免疫印迹(Western Blot)

3 统计学分析

4 结果

4．1 IFN-γ诱导HMC表达CXCL9、CXCL10和CXCL11增强，呈剂量依赖性和时间依赖性

4．2 IFN-γ通过JAK／STAT1信号通路诱导HMC趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11的表达

5 讨论

6 小结

系统性红斑狼疮患者血清及尿液CXCL9、CXCL10、CXCL11的表达及临床意义

1 研究对象

1．1 病例来源

1．2 病例分组

2 实验材料

2．1 主要仪器和耗材

2．2 主要试剂

3 实验步骤

3．1 ELISA检测血清及尿液CXCL9、CXCL10、CXCL11的水平

3．2 临床指标检测

4 统计学分析

5 结果

5．1 SLE组与健康对照组血清CXCL9、CXCL10、CXCL11水平的比较分析

5．2 LN组、无肾炎组、健康对照组血清CXCL9、CXCL10、CXCL11水平比较

5．3 SLE患者血清趋化因子水平与部分临床辅助诊断指标的相关性分析

5．4 SLE患者尿液CXCL9、CXCL10、CXCL11水平与健康对照组比较

5．5 LN组、无肾炎组、健康对照组尿液CXCL9、CXCL10、CXCL11水平比较

5．6 ROC曲线分析

6 讨论

7 小结

结论

参考文献

附录

致谢

文献综述

作者简历