大黄素调控PTEN/PI3K/AKT信号途径对MCAO再灌注大鼠作用的影响

摘要

目的:本课题研究大黄素对MCAO再灌注模型大鼠的神经保护作用，并探讨大黄素通过调控PTEN/PI3K/AKT信号途径对MCAO再灌注模型大鼠的神经保护作用的影响。
　　方法:(1)将健康成年雄性SD大鼠30只分为五组:假手术组（sham组）6只、MCAO再灌注模型组（MCAO组）6只、大黄素低剂量组（MCAO+EL组）6只、大黄素中剂量组（MCAO+EM组）6只、大黄素高剂量组（MCAO+EH组）6只。造模完成后，立即灌胃给药。大黄素用0.5％的羧甲基纤维素钠溶液配制，其低、中、高剂量组的给药剂量依次为25mg·Kg-1·d-1、50mg·Kg-1·d-1和100mg·Kg-1·d-1，给药一次。给药24h后取材，用于TTC染色。
　　(2)将健康成年雄性SD大鼠27只分为三组:假手术组（sham组）9只、MCAO再灌注模型组（MCAO组）9只、大黄素组（MCAO+Emodin组）9只。造模完成后，立即灌胃给药。大黄素给药剂量为50mg·Kg-1·d-1，给药一次。给药24h后取材。用于Nissl染色，NeuN、C3、GFAP免疫荧光染色，中性粒细胞染色，E-selectin、GFAP、PTEN、p-AKT和AKT蛋白表达量的检测。
　　(3)健康成年雄性SD大鼠18只，随机分为侧脑室注射人工脑脊液组9只，侧脑室注射PI3K抑制剂组9只。从人工脑脊液组和PI3K抑制剂组中分别随机选取6只，进行MCAO再灌注造模，造模后分为模型组和大黄素给药组，其分别为人工脑脊液假手术组（sham组）3只、PI3K抑制剂假手术组（LYsham组）3只、人工脑脊液模型组(MCAO组)3只、PI3K抑制剂模型组（LYMCAO组）3只、人工脑脊液给药组(MCAO+Emodin组)3只和PI3K抑制剂给药组（LYMCAO+Emodin组）3只，PI3K抑制剂浓度为LY294002浓度为10μL10Mm，大黄素给药剂量为50mg·Kg-1·d-1，给药一次。24h后取大鼠缺血侧脑组织，检测其p-AKT、AKT、p65、Bcl-xl、Bax、IL-1β的表达量。
　　结果:(1)MCAO再灌注模型大鼠经大黄素作用24h后，取材，与模型组相比，TTC染色结果显示，MCAO+EM组和MCAO+EH组能够降低大鼠缺血侧脑梗死体积，MCAO+EL不能降低大鼠脑梗死体积;Nissl染色结果显示，与sham组相比，模型组Nissl小体阳性表达减少，经大黄素作用后，Nissl阳性细胞数量表达显著上升;免疫荧光法对NeuN染色结果显示，与sham组相比，模型组NeuN表达减少，给药后NeuN表达显著上升;与sham组相比，模型组TNF-α、IL-1βmRNA表达显著增加，给药后TNF-α、IL-1βmRNA表达与模型组相比显著下降。
　　(2)MCAO再灌注模型大鼠经给大黄素作用24h后，取材，结果显示，与sham组相比，模型组PTEN、E-selecin表达显著增加，给药后表达显著下降;模型组p-AKT的表达显著下降，给药后明显升高;免疫荧光结果显示，与sham组相比，模型组C3、GFAP表达显著增加，给药后其表达显著下降;中性粒细胞染色结果显示，大鼠造模后病灶区的中性粒细胞显著增多，给药后能明显减低中性粒细胞在病灶区的聚集。
　　(3)大鼠侧脑室注射PI3K抑制剂后进行MCAO再灌注造模，大黄素给药24h后，取材，结果显示，与MCAO+Emodin组相比，LYMCAO+Emodin组p-AKT/AKT、Bcl-xl表达显著下降，而p65、Bax及IL-1β明显上升。
　　结论:(1)大黄素能有效降低MCAO再灌注大鼠的脑梗死体积，减少由MCAO再灌注引起的炎症损伤，抑制细胞凋亡;并减少中性粒细胞的募集，补体系统的激活以及血管内皮细胞黏附因子的生成，因此具有良好的神经保护作用和抗炎作用。
　　(2)大黄素具有的神经保护作用和抗炎作用是通过调控PTEN/PI3K/AKT信号实现的。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

引言

第一部分 大黄素对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用和抗炎作用

l 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 实验仪器

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 大鼠MCAO再灌注模型的制作

2．2 神经功能损伤的评分

2．3 大鼠的分组与给药

2．4 TTC染色法定量分析大鼠脑梗死体积

2．5 免疫荧光法定量分析大鼠脑组织中NeuN、C3、GFAP

2．6 尼氏染色法对大鼠脑组织的尼氏小体进行染色

2．7 荧光定量PCR测大鼠缺血侧脑组织1L-1β、TNF-αmRNA的表达

2．8 Westenblot测大鼠缺血侧脑组织的E-selectin的蛋白表达

2．9 中性粒细胞染色定量分析大鼠脑组织的中心粒细胞

2．10 数据统计

3 结果

3．1 大黄素降低MCAO大鼠脑缺血的梗死体积

3．2 大黄素对大鼠脑缺血侧神经细胞数目的影响

3．3 大黄素对大鼠脑缺血侧NeuN表达的影响

3．4 大黄素对MCAO大鼠缺血侧脑组织TNF-α、1L-1βmRNA表达的影响

3．5 大黄素对大鼠缺血侧C3表达的影响

3．6 大黄素对大鼠缺血侧E-selectin表达的影响

3．7 大黄素对大鼠缺血侧中性粒细胞的影响

3．8 大黄素对大鼠脑缺血侧GFAP表达的影响

4 讨论与小结

4．1 讨论

4．2 小结

第二部分 大黄素通过PTEN／PI3K／AKT对大鼠脑缺血侧作用的影响

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药品

1．3 实验仪器

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 侧脑室注射LY294002

2．2 大鼠MCAO再灌注模型的制作

2．3 神经功能评分

2．4 分组与给药

2．5 Westenblot测大鼠缺血侧脑组织的PTEN、AKT、p-AKT、Bax和Bcl-xl的蛋白表达

2．6 荧光定量PCR测大鼠缺血侧脑组织1L-1β的表达

2．7 数据统计

3 结果

3．1 大黄素对大鼠缺血侧PTEN、AKT蛋白表达的影响

3．2 大黄素对侧脑室注射PI3K抑制剂大鼠缺血侧p-AKT／AKT蛋白表达的影响

3．3 大黄素对侧脑室注射PI3K抑制剂大鼠缺血侧p-AKT、p-p65、Bax和Bcl—xl蛋白表达的影响

3．4 大黄素对侧脑室注射PI3K抑制剂大鼠缺血侧p65、1L-1β表达的影响

4 讨论与小结

4．1 讨论

4．2 小结

结论

参考文献

综述

致谢

作者简历