基于内质网应激PERK/ATF4信号通路研究栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注损伤大鼠的治疗机制

摘要

目的：本研究通过制备大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusions，MCAO)大鼠模型，研究栝楼桂枝汤（Gualou-Guizhi Decoction，GLGZD）对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用，并深入探究GLGZD是否通过调控蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase R(PKR)-like ER kinase，PERK)/转录活化因子4（Activating transcription factor4，ATF4）信号通路以改善内质网应激进而减轻脑缺血后神经细胞损伤，为脑卒中后神经功能康复的临床用药提供科学依据。
　　方法：(1)模型的建立、分组及给药：采用线栓法制备大鼠MCAO大鼠模型，并进行神经功能评分，将评分为2～4分的大鼠随机分为MCAO组、GLGZD低、中、高剂量组以及尼莫地平组，另设假手术组。各组大鼠于手术当日给予相应的药物，1次/d，连续干预7d。(2)GLGZD对MCAO大鼠的治疗作用：GLGZD干预7d后，采用longa神经功能评分评价大鼠的神经行为障碍;TTC染色法检测大鼠脑梗死体积;HE染色法观察大鼠缺血侧大脑皮层神经细胞的病理变化;Tunel法检测大鼠缺血侧大脑皮层神经细胞的凋亡率。(3)GLGZD对PERK/ATF4信号通路相关因子表达的影响：荧光探针法检测大鼠缺血侧大脑皮层中Ca2+、ROS含量;qRT-PCR法检测大鼠缺血侧大脑皮层中GRP78、ATF4、CHOP、Ero-1α、Bcl-2、IP3R、SERCA、Bax的mRNA表达;Western-Blot法检测GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2、Caspas-3、cleaved Caspase-3、Ero-1α、SERCA2α、Bax的总蛋白表达以及ATF4的核蛋白表达;免疫荧光法定位定量分析GRP78蛋白的表达;免疫组化法定位定量分析IP3R蛋白的表达。
　　结果：1.GLGZD对MCAO大鼠的治疗作用：经GLGZD干预后，神经功能评分、脑梗死体积和缺血侧大脑皮层神经细胞的凋亡率均较MCAO模型组明显减轻(P＜0.05或0.01)。HE染色结果显示：MCAO组大鼠缺血侧皮层的神经细胞出现细胞排列紊乱、结构破坏、胞体缩小、胞质凝集、细胞核固缩深染等凋亡或坏死现象，并伴有间质水肿和炎性细胞浸润。经GLGZD干预后，各组的上述病理状态均明显改善。
　　2.GLGZD对PERK/ATF4信号通路相关因子表达的影响：(1)大鼠缺血侧大脑皮质中Ca2+、ROS含量测定结果显示：与MCAO组相比，GLGZD各剂量组大鼠缺血皮层神经细胞的Ca2+、ROS含量均明显减少(P＜0.05或0.01);(2)qRT-PCR法检测相关因子的mRNA表达结果显示：GLGZD干预后能够明显下调GRP78、ATF4、CHOP、IP3R、Ero-1α、Bax mRNA的表达(P＜0.05或0.01)和上调SERCA2α、Bcl-2mRNA的表达(P＜0.05或0.01);(3)Western-Blot法检测相关蛋白表达的结果显示：①造模后大鼠缺血皮层中GRP78、ATF4、CHOP、Ero-1α、Bax的总蛋白表达明显升高(P＜0.01)、ATF4核蛋白表达升高(P＜0.01)，而SERCA2α和Bcl-2总蛋白表达显著降低（P＜0.01）;经GLGZD干预后，GRP78、ATF4、CHOP、Ero-1α、Bax的总蛋白表达以及ATF4核蛋白表达明显低于MCAO组(P＜0.05或0.01)，而SERCA2α和Bcl-2总蛋白表达较MCAO组显著升高(P＜0.05或0.01)。②MCAO大鼠缺血皮层中，PERK和eIF2α的磷酸化水平及Caspase-3的活化水平均明显升高（P＜0.05或0.01），GLGZD干预后，可明显下调PERK和eIF2α的磷酸化水平及Caspase-3的活化水平(P＜0.05或0.01)。(4)免疫荧光法检测GRP78蛋白表达的结果显示：造模后，大鼠缺血侧皮层中GRP78表达水平明显上调(P＜0.01)，且蛋白主要表达于胞质中。而GLGZD干预后能明显下调GRP78的表达水平(P＜0.05或0.01)。(5)免疫组化法检测IP3R蛋白表达的结果显示：造模后，大鼠缺血侧皮层中IP3R表达水平明显升高（P＜0.01），且主要表达于细胞核及胞浆中。而GLGZD干预后可明显降低IP3R蛋白的表达水平(P＜0.01)。
　　结论：GLGZD能够抑制大脑皮层神经细胞的缺血性凋亡，改善缺血区域神经细胞的病理状态，进而减少脑梗死体积，发挥神经保护作用，而这一作用与GLGZD调控PERK/ATF4信号通路进而抑制内质网应激有关。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

引言

第一章 栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用研究

1 材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 实验仪器

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 栝楼桂枝汤的制备

2．2 大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立

2．3 实验分组与给药方法

2．4 神经功能评分

2．5 TTC染色法

2．6 组织石蜡切片的制作

2．7 组织病理观察(HE染色)

2．8 细胞凋亡率检测(Tunel法)

2．9 实验结果统计学分析

3 实验结果

3．1 GLGZD对MCAO模型大鼠神经功能评分的影响

3．2 GLGZD对MCAO缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响

3．3 GLGZD对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧大脑皮层组织病理变化的影响

3．4 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层神经细胞凋亡的影响

4 讨论

5 小结

第二章 栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注损伤大鼠内质网应激PERK／ATF4信号转导的调控作用

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 实验仪器

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 动物组织取材

2．2 实时荧光定量qRT-PCR模板DNA的制备及相应指标的定量检测

2．3 蛋白样品的制备

2．4 Western-Blot法测定PERK/ATF4相关蛋白的表达

2．5 免疫组织化学法检测IP3R蛋白表达水平

2．6 免疫荧光法检测GRP78蛋白表达水平

2．7 荧光探针法检测缺血皮层组织中Ca2+、ROS含量

2．8 数据处理与分析

3．1 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层GRP78 mRNA和总蛋白表达的影响

3．2 GLGZD对MCAO大鼠缺血皮层中PERK、elF2α蛋白磷酸化水平的影响

3．3 GLGZD对MCAO大鼠缺血皮层中ATF4 mRNA和总蛋白表达的影响

3．4 GLGZD对MCAO大鼠缺血皮层中CHOP mRNA和总蛋白表达的影响

3．5 GLGZD对MCAO大鼠缺血皮层中Ero-1α mRNA和总蛋白表达的影响

3．6 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层中Bcl-2 mRNA和总蛋白表达的影响

3．7 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层中Bax mRNA和总蛋白表达的影响

3．8 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层中Caspase-3激活的影响

3．9 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层中ROS和Ca2+含量的影响

3．10 GLGZD对MCAO大鼠缺血侧皮层中SERCA2α、IP3R mRNA和总蛋白表达的影响

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

文献综述

致谢

作者简历