石斛合剂序贯法对糖尿病合并肝纤维化大鼠IKK/NF-κB/IκB信号通路的影响

摘要

目的：观察石斛合剂序贯法对糖尿病合并肝纤维化大鼠IKK/NF-κB/IκB信号通路相关蛋白表达的影响，为石斛合剂序贯法防治糖尿病合并肝纤维化提供实验及理论依据。
　　方法：选用SPF级Wistar大鼠(体重200±10g，雄性)70只，适应性喂养7天后，按随机数表法随机分为正常对照组10只和造模组60只。正常对照组予普通饲料喂养，造模组予高脂高糖饲料喂养。6周后，造模组空腹腹腔注射STZ{25mg/(kg+m2)，间隔72h}2次，正常对照组腹腔注射生理盐水。选取T2DM成模的大鼠50只随机分为模型对照组、石斛合剂序贯方组、二甲双胍组、石斛合剂1方组、石斛合剂2方组各10只并在灌胃同时皮下注射CCl4(2ml/kg，每周2次)，首剂加倍;正常对照组注射生理盐水。各组统一于糖尿病成模并分组后第3天灌胃，每周称重一次，每周根据体重调整注射及灌胃药量。于CCl4注射及灌胃处置第8周末取材，经腹主动脉采血，采用全自动生化仪检测ALT、AST，放射性免疫法测肝纤维化四项HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ;取肝组织行HE和Masson染色、免疫组化测肝组织collagen-Ⅳ表达量;Western blot检测大鼠肝脏IKKβ、NF-κBP50、NF-κBP65、IκBβ及p-IκBβ的蛋白相对表达量。
　　结果：1.大鼠一般情况观察：正常对照组一般状况良好，模型对照组一般情况较差，其余各治疗组较模型对照组明显改善。
　　2.大鼠空腹血糖变化：药物干预前，与正常对照组比，各组的空腹血糖均显著升高，且≥11.1mmol/L(P＜0.01);模型对照组、石斛合剂序贯方组、二甲双胍组、石斛合剂1方组、石斛合剂2方组每两组之间空腹血糖无差异(P＞0.05）;药物干预后，与正常对照组相比，各用药组无明显差异(P＞0.05)，与模型对照组比，各用药组空腹血糖均明显下降(P＜0.01)。
　　3.大鼠肝功能变化：治疗后，与正常对照组比，各治疗组AST、ALT均较高(P＜0.01);与模型对照组相比，各治疗组AST、ALT明显降低，存在显著差异（P＜0.01），各治疗组之间无显著差异(P＞0.05);且石斛合剂序贯方组ALT降低更明显。
　　4.大鼠肝纤维化四项变化：治疗后，与正常对照组相比，模型对照组的HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ显著升高，有显著差异(P＜0.01);与模型对照组相比，各治疗组组HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ均存在显著差异。
　　5.大鼠肝组织HE染色：治疗后，与正常对照组相比，模型对照组肝组织结构发生明显变化，有大量的结缔组织增生及胶原蛋白沉积，正常结构几乎完全被破坏，肝细胞排列紊乱，肝细胞脂肪变性较严重，有大量脂肪空泡，肝索结构几乎消失，伴有大量炎细胞浸润;与模型对照相比，各治疗组肝索结构有所恢复，脂肪变性、炎性改变及结构破坏程度明显改善，石斛合剂序贯方组结缔组织增生及胶原蛋白沉积较其他治疗各组改善更明显，肝血窦明显减小。
　　6.大鼠肝组织Masson染色：治疗后，与模型对照相比，各治疗组胶原纤维较模型对照组明显减少，纤维纵隔明显变细，且石斛合剂序贯方组纤维组织沉积最少，纵隔最细。
　　7.大鼠肝组织Collagen-Ⅳ免疫组化：模型对照组有大量Collagen-Ⅳ（淡黄色）沉积在肝细胞外间质，各治疗组均有减少，且石斛合剂序贯方组淡黄色区域最少，即石斛合剂序贯方组对减少collagen-Ⅳ沉积疗效最佳。
　　8.大鼠肝脏组织IKKβ、IκBβ、P-IκBβ、NF-κBP65、NF-κBP50蛋白表达：与正常对照组相比，模型对照组NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表达量升高，IκBβ、P-IκBβ表达量降低，均存在显著差异(P＜0.01)，与模型对照组相比，各治疗组NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表达均有降低，IκBβ，P-IκBβ表达量升高，存在显著差异(P＜0.01)。
　　结论：1.高脂高糖饲料+STZ联合CCl4能成功建立糖尿病合并肝纤维化动物模型。
　　2.石斛合剂序贯方可改善高脂高糖+STZ联合CCl4所致的糖尿病合并肝纤维化模型大鼠的血糖水平、肝功能指标(ALT、AST)、肝纤维化指标(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ);能减轻大鼠肝脏的胶原蛋白及胶原纤维沉积;
　　3.石斛合剂序贯方可能通过作用IKK/NF-κB/IκB信号通路，下调NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ的表达量及上调IκBβ、p-IκBβ表达量，抑制糖尿病大鼠的肝纤维化。

目录

声明

英文缩略词

摘要

引言

材料与方法

1 材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物

1．3 主要仪器

1．4 主要试剂

1．5 主要试剂配置

1．6 动物饲料配方

2 实验方法

2．1 动物分组及造模方法

2．2 实验动物的干预及取材

2．3 指标检测

2．4 技术路线图

3 统计学方法

实验结果

1 大鼠一般情况观察

2 各组实验大鼠治疗前后血糖

3 各组实验大鼠治疗后肝脏变化情况

3．1 肝功能(AST、ALT)

3．2 肝纤维化四项

3．3 肝脏组织HE染色

3．4 肝脏组织Masson染色

3．5 肝组织免疫组化(collagen-Ⅳ)

3．6 肝脏组织IKKβ、IκBβ、P-IκBβ、NF-κBP65、NF-κBP50蛋白表达

讨论

1 糖尿病与非酒精性脂肪病的关系

2 糖尿病合并肝纤维化模型探讨

2．1 糖尿病模型

2．2 肝纤维化模型

2．3 糖尿病合并肝纤维化模型

3．2 依赖IKK复合体降解IκB的NF-κB信号激活途径

3．3 IKK／NF-κB／IκB信号通路与肝纤维化

3．4 IKK／NF-κB／IκB信号通路研究

4 糖尿病合并肝纤维化临床症状及治疗现状

5 DMOC立论依据

6 DMOC对糖尿病合并肝纤维化模型大鼠的作用

7 问题与展望

结论

参考文献

文献综述 中医从肝论治2型糖尿病

致谢

作者简历