小立碗藓冷胁迫下表达序列标签分析及其相关基因Cor166的功能初探

摘要

低温是影响植物生长、发育及地理分布的一个重要生态因子，限制了冷敏感作物在低温季节的种植，导致光合效率低下，作物产量降低。深入研究植物冷适应机理对于农业生产如改良作物、增加冷季节的作物品种等意义重大。小立碗藓(Physcomitrellapatens)是最近几年发展起来的模式植物系统。其分布广、极耐逆境、易培养、培养周期短，容易进行遗传转化和同源重组。小立碗藓长期处于单倍体世代，对于遗传学研究来讲，单倍体植物基因突变或敲除所产生的形态或生理生化变化容易被监测到，这些使研究植物抗逆基因的功能极为方便。 本实验构建了一个小立碗藓配子体冷胁迫的SSHcDNA双向文库。在正、反向文库中，分别随机挑选了384个阳性克隆，进行斑点杂交。根据斑点杂交的信息，分别在正、反向文库中挑选了240个和180个克隆单向测序，各获得232条和162条EST。通过BLSTx和BLSTxn与GenBank的数据库比较，在正向文库的232条EST中，有215条EST具有编码蛋白质功能，其余17条EST序列与已知蛋白质同源性较低或找不到任何同源序列。在反向文库的162条EST中，有134条EST具有编码蛋白质功能，其余28条EST序列与已知蛋白质同源性较低或找不到任何同源序列。在正向文库的215条具有编码蛋白质功能的EST中，120条EST序列的功能已知，95条EST与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性；在反向文库的134条具有编码蛋白质功能的EST中，104条EST序列的功能已知，30条EST与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性。这些已知的功能基因分别来自32个(正向文库)和27个物种(反向文库)。正向文库的已知功能基因30.3％来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、15.8％来自水稻(Oryzasativa)、7.9％来自小麦(Triticumaestivum)、1.3％来自于小立碗藓(physcomitrellapatens)；反向文库的已知功能基因19.8％来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、12.7％来自水稻(Oryzasativa)、11.6％来自于小立碗藓(Physcomitrellapatens)、5.8％来自于烟草(Nicotianatobacum.L)。对上述240条和180条EST片段进行重叠群分析分别有126条和106条非冗余EST，正向文库里有106条单一序列和20个重叠群；反向文库里有90条单一序列和16个重叠群。 对文库EST分析后表明，ABA、Ca2+、一些蛋白激酶参与了小立碗藓的冷胁迫信号转导过程；热激转录因子、AP2结合结构域转录因子、MYC相关的DNA结合蛋白、MYB家族转录因子、bZIP转录因子等转录因子参与了冷胁迫下下游基因的表达调控；离子通道蛋白、水通道蛋白、膜通道蛋白、Rab蛋白等参与了物质和能量的跨膜运输；脂肪酸去饱和酶保护了冷胁迫对细胞膜的伤害；锰超氧化物歧化酶、过氧化物还原酶、过氧化氢酶，谷胱甘肽分解酶等参与了解除冷胁迫下细胞过氧化物升高导致的毒性的过程；泛素系统在分解变性蛋白的过程中起到主要作用；LEA蛋白参与了细胞保水及维持相关酶的活性的过程。对类似LEA3蛋白的cor166LEA基因的RT-PCR、Northernblot分析表明：Cor166LEA基因在冷处理12小时时有微弱的上调表达，冷处理24小时表达加强，48小时达到最大，72小时时下调。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1植物抗寒的分子生物学研究进展

2植物抗寒过程中基因表达谱研究技术

3小立碗藓的分子遗传学及其抗寒基因研究现状

4立题意义与技术路线

第二章小立碗藓冷诱导抑制性差减杂交(SSH)文库的构建及其基因表达谱分析

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三章类似LEA基因的Cor166的克隆及表达分析

结论

参考文献

主要名词缩写

附录一 克隆PCR鉴定图：

附录二 斑点杂交信号表

致谢

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