桃（Prunus persica）两种MADS box基因的克隆及其功能分析

摘要

了解植物由营养生长向生殖生长的转变的调节过程，对于控制有花植物的生长发育是很有意义的。至今已经鉴定了许多参与控制果实和花发育的MADSbox基因。　　MADSbox基因对生殖生长的调控是近年来MADSbox基因作用研究的重点。为了研究李属(Prunussp.)果树生殖调控的相关基因，对国际公共数据库中的李属植物的EST(Expressedsequencetags)序列进行了电子拼接，获得了8个MADSbox基因的cDNA序列，并利用PCR技术从桃的果实中克隆出其中的4个cDNA，分别命名为PpMADS2、PpMADS4、PpMADS6和PpMADS7,其中PpMADS4和PpMADS6在GenBank中的登陆号分别为AY705972和AY705973。PpMADS4基因长850bp，包含一个732bp的开放阅读框，编码243个氨基酸。PpMADS6基因长1190bp，包含1个768bp的开放阅读框，编码256个氨基酸。　　PpMADS4和PpMADS6在序列上分别与拟南芥中的AGAMOUS基因和矮牵牛中的PFG基因高度同源。RT-PCR分析表明，PpMADS4基因在花瓣、心皮、果实及核仁中表达，应属于已知的花器发育的调控的C类MADSbox基因。PpMADS6基因在萼片、花瓣、心皮、果实及果仁中表达，应属于调控植物由营养生长向生殖生长过渡的A类MADSbox基因。　　为了进一步确定基因的功能，对PpMADS4基因进行了拟南芥转基因分析。通过限制性内切酶切割和连接反应，构建该基因的正义表达载体，并置于CaMV35S启动子的驱动之下。利用农杆菌介导的浸渍法转化拟南芥。将通过抗生素筛选的阳性植株，使用CTAB法提取成株基因组DNA，进行PCR检测。　　通过对于转基因拟南芥的表型观察，发现株型与花型均发生了改变，这些特征，与AGAMOUS基因在拟南芥中的异位表达结果相似。这些结果表明PpMADS4基因应与C类基因具有相似的功能。

目录

论文说明：缩写

第一章引言

一、ABC模型研究进展

1、同源异型基因

2、同源异型基因和ABC模型

3、ABC模型的研究进展

二、植物MADS BOX基因研究进展

1、MADS box基因的起源、进化

2、MADS box基因的结构特性

3、植物MADSbox基因的功能

4、植物MADS box基因的分类

5、植物MADS box基因的分布

6、植物MADS box基因参与植物花发育的调控

7、植物MADS box基因的生物学功能及其多效性

8、植物MADS box基因研究存在的问题与展望

三、本实验研究目的

第二章 材料与方法

一、实验材料

1、植物材料

2、菌株

3、质粒载体

4、酶、抗生素各种试剂

5、培养基的配制

6、常用抗生素母液浓度

7、常用溶液

8、引物

9、实验中所用试剂盒

10、实验中所用程序及软件

二、实验方法

1、目的基因的克隆

2、基因的序列分析与表达分析

3、载体的构建

4、农杆菌GV3101感受态细胞的制备及转化

5、农杆菌介导的拟南芥转化(浸渍法)

6、DNA的提取与纯化

第三章结果与分析

一、目的基因的克隆

1、李属主要EST数据的整合和MADS box同源物的筛选。

2、基因的克隆

二、基因的序列分析与表达分析

1、基因序列分析

2、PpMADS4和PpMADS6蛋白的同源性比对和蛋白结构分析

3、PpMADS4和PpMADS6蛋白的系统进化分析

4、PpMADS4与PpMADS6基因的RT-PCR分析

三、表达载体的构建与鉴定

四、农杆菌介导的拟南芥转化及鉴定(COLUMBIA生态型)

1、抗性株的筛选

2转基因拟南芥的PCR鉴定

三、转基因拟南芥的表型观察

四、农杆菌介导的LANDSBERG生态型拟南芥转化

第四章讨论

1、李属EST数据分析

2、PpMADS6蛋白的功能

3、PpMADS4蛋白的功能

4、进一步研究工作

参考文献

致谢

附录