大白菜抗芜菁花叶病毒SSR标记及其系统获得性抗性反应基因表达分析

摘要

芜菁花叶病毒(简称TuMV)是感染大白菜的最重要的病毒之一，本文首先从EST开发SSR标记。对大白菜13,007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群，从中筛选SSR标记，选取123个长度在14bp以上的SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒的高抗和高感大白菜自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中有37个标记可以进行有效扩增，但没有表现出多态性，有23个标记至少在一份材料中表现多态性。为了研究大白菜对TuMV抗性的分子基础，对其中一组高抗和高感芜菁花叶病毒的大白菜自交系接种TuMV-C3株系，在接种后三个时间点(7天、14天和21天)取非接种叶片提取总RNA，利用本实验室开发的大白菜cDNA微阵列进行杂交分析，在高抗自交系中3个时间点上共有1749个基因上调表达和70个基因下调表达。这些基因被认为是参与大白菜对芜菁花叶病毒系统获得抗性反应的基因。本研究利用分子标记技术找到了与抗芜菁花叶病毒相关的大白菜EST-SSR标记，为大白菜遗传图谱的构建、抗芜菁花叶病毒基因的定位以及其它芸薹属植物SSR标记的分析提供重要信息。利用DNA芯片技术，在基因表达水平上筛选出与抗芜菁花叶病毒系统获得抗性反应相关的基因。这些基因为研究植物系统获得抗性及抗TuMV机制提供了大量基因表达信息，也为TuMV抗病基因的筛选奠定了基础。

目录

摘要

1.前言

1.1分子标记技术研究进展

1.2表达序列标签（Expressed Sepuence Tags,ESTs）微卫星标记的开发

1.3TuMV(Turnip mosaic virus,TuMV)的特点及基因组结构功能

1.3.1 TuMV的危害

1.3.2 TuMV株系的分类

1.3.3控制TuMV的传播

1.3.4 TuMV的基因组结构和基因功能

1.3.5 TuMV的致病决定因素

1.4芸薹属植物中的抗TuMV基因及其它抗性基因

1.4.1芸薹属植物中的抗TuMV基因

1.4.2芸薹属植物中与抗病相关的QTL

1.5植物对病毒的抗性反应

1.6 DNA Microarray在植物基因差异表达分析上的应用

2.材料和方法

2.1 SSR标记筛选

2.1.1 EST序列来源

2.1.2 EST序列的片段重叠群（Contig）分析

2.1.3 EST序列中SSR筛选

2.1.4 SSR分布区域的确定

2.2大白菜抗芜菁花叶病毒EST-SSR标记的筛选

2.2.1植物材料

2.2.2基因组DNA的提取(CTAB法)

2.2.3引物设计

2.2.4 PCR扩增

2.2.5变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测SSR多态性

2.3高抗和高感芜菁花叶病毒大白菜基因表达差异分析

2.3.1植物材料

2.3.2接种病毒

2.3.3酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）鉴定抗、感材料的抗病性

2.3.4 TE3D法提取植物总RNA

2.3.5大白菜DNA微阵列(DNA Microarray)

2.3.6 RNA样品的纯化、荧光标记及Microarray杂交

3.结果与分析

3.1 EST-SSR分布情况

3.2 EST不同区域的SSR分布比较

3.3大白菜EST-SSRs的多态性分析

3.4抗、感品种的抗病性鉴定

3.5高抗和高感芜菁花叶病毒大白菜基因表达差异分析

3.6差异表达基因功能分类

3.7与系统获得抗性反应相关的上调表达蛋白

3.7.1与细胞防卫有关的上调表达蛋白

3.7.2与信号转导有关的上调表达蛋白

3.7.3与水杨酸、茉莉酸介导的信号转导途径有关的上调表达蛋白

3.7.4上调表达的转录因子

4.讨论

4.1 EST-SSR频率和分布

4.2 EST-SSR标记的开发

4.3抗、感材料间的抗病性差异及遗传背景差异

4.4差异基因表达聚类分析

4.5系统获得抗性(SAR)的诱导

4.6与病程相关蛋白

4.7抗病信号传导途径

4.8转录因子WRKY的功能

参考文献

致谢

附录Ⅰ在大白菜4份自交系材料中具有多态性的EST-SSR标记

附录Ⅱ大白菜高抗TuMV自交系中与防御相关的上调表达蛋白