肌动蛋白和肌球蛋白存在于烟草悬浮系细胞核及核骨架中的证据

摘要

BY-2型烟草叶片消毒后接种在附加0.5mg/L 2,4-D和0.5g/L酪蛋白的MS培养基中诱导培养，经3-4次继代后，即可得到分散性好、疏松、色泽呈鲜艳黄白色的愈伤组织；将该种愈伤组织接种在附加1mg/L 2,4-D的MS液体培养基中进行振荡培养，经4-5次继代后，即可建立起良好的烟草悬浮系。双酶解法去除烟草悬浮系细胞的细胞壁，获得分散均匀的原生质体。由于技术上的问题，分离得到高纯度的植物悬浮系细胞的细胞核一直是个难点。本研究借鉴动物细胞核的提取方法用含有0.5﹪TritonX-100的CSK缓冲液破坏烟草悬浮系细胞的细胞膜，释放出细胞器。然后参考成株植物细胞核的提取方法采用差速离心和蔗糖-Percoll速率区带离心法最终获得了高纯度的细胞核。向细胞核中加入PI至终浓度为50μg/ml，冰上黑暗染色，上流式细胞仪观察分析，统计正常培养条件下烟草悬浮系细胞所处的细胞周期，结果显示正常培养条件下83.41﹪的细胞处于G<,0>+G<,1>期。接下去，先后用DNase I消化和高盐抽提制备细胞核骨架；同时用试剂盒提取细胞核总蛋白。以兔抗β-肌动蛋白的抗体作一抗，辣根过氧化物酶标记(HRP)的羊抗兔抗体作二抗进行免疫印迹。实验结果证实，烟草悬浮系细胞的细胞质、细胞核及核骨架中均存在与β-肌动蛋白抗体呈阳性反应的抗原。以兔抗细胞核肌球蛋白I β的抗体作一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体作二抗进行免疫印迹。实验结果显示，烟草悬浮系细胞的细胞核中存在与细胞核肌球蛋白I β抗体呈阳性反应的抗原而核骨架中则没有。上述实验结果证实，β-肌动蛋白是烟草悬浮系细胞核及核骨架的组成成分，同时细胞核肌球蛋白I β也是其细胞核的组成成分。本实验首次找到了发现于小鼠纤维原细胞细胞核并普遍存在于动物细胞核中的肌球蛋白I β同样也存在于烟草悬浮系细胞核中的证据，填补了一项科研空白。作者推测了肌动蛋白和肌球蛋白在植物细胞核及核骨架中存在的意义和可能发挥的作用，同时认为细胞核中的肌动蛋白和肌球蛋白在生物进化过程中可能是相当保守的。

目录

文摘

英文文摘

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第一章引言

1.1细胞核骨架的概述

1.1.1核骨架与DNA复制的关系

1.1.2核骨架与基因表达

1.1.3核骨架与染色体构建的关系

1.1.4核骨架与病毒复制

1.2肌动蛋白的概述

1.2.1细胞核肌动蛋白及存在形式

1.2.2肌动蛋白的核质运输

1.2.3细胞核肌动蛋白与染色质结构调整

1.2.4细胞核肌动蛋白参与基因转录活动

1.2.5细胞核肌动蛋白参与RNA的加工与运输

1.3肌球蛋白的概述

1.3.1第Ⅰ类肌球蛋白

1.3.2细胞核中β-actin与NMⅠβ的功能预测

1.4本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1实验材料及试剂:

2.1.1实验材料：BY-2型烟草(由印丽萍老师实验室馈赠)。

2.1.2实验试剂：

2.1.3实验设备：

2.2实验方法：

2.2.1烟草愈伤组织的诱导

2.2.2烟草细胞悬浮系的建立

2.2.3原生质体的制备

2.2.4细胞核与叶绿体的分离提纯

2.2.5细胞核的保存

2.2.6流式细胞术测量烟草悬浮系细胞所处的细胞周期

2.2.7细胞核总蛋白及核骨架蛋白的分步提取

2.2.8蛋白SDS-PAGE

2.2.9免疫印记检测β-actin和NMⅠβ

第三章结果与分析

3.1烟草愈伤组织及其悬浮系的建立

3.1.1烟草愈伤组织的建立

3.1.2烟草细胞悬浮系的建立

3.2原生质体制备

3.3细胞核与叶绿体的分离与纯化

3.3.1粗提细胞核与叶绿体

3.3.2纯化细胞核与叶绿体

3.3.3细胞核纯化的比率

3.4不同培养条件下烟草悬浮系细胞的生长情况及所处细胞周期

3.4.1不同培养条件下烟草悬浮系细胞的生长情况及细胞核提取情况的不同

3.4.2不同培养条件下烟草悬浮系细胞所处的细胞周期

3.5蛋白电泳结果与分析

3.5.1细胞质总蛋白SDS-PAGE电泳结果

3.5.2细胞核总蛋白SDS-PAGE电泳结果

3.5.3细胞核骨架蛋白SDS-PAGE电泳结果

3.5.4染色质蛋白与核骨架外周蛋白SDS-PAGE电泳结果

3.5.5烟草悬浮系蛋白分步提取SDS-PAGE电泳总谱

3.6免疫印迹检测β-actin与NMⅠβ

3.6.1免疫印迹检测β-actin

3.6.2免疫印迹检测NMⅠβ

第四章讨论与展望

4.1烟草悬浮系细胞核的提取和纯化

4.1.1植物细胞核的纯化问题

4.1.2植物蛋白数据库的不完善

4.2利用流式细胞术测量烟草悬浮系细胞周期的分布

4.3对于β-actin、NMⅠβ是否存在于烟草悬浮系细胞核及核骨架中的鉴定与功能预测

第五章结论

参考文献

附 录

附录Ⅰ：缩写词一览表

附录Ⅱ：硕士期间发表论文

致 谢