代谢木糖和葡萄糖产乙醇的重组酿酒酵母的构建

摘要

木质纤维素是地球上最充分的有机资源。将木质纤维素中的纤维素和半纤维素水解成葡萄糖和木糖并发酵产生乙醇正在被广泛地研究。木糖发酵是植物纤维原料生物转化制取乙醇商业化生产的基础和关键,但自然界存在的微生物菌株不能满足商业化生产的需要。利用基因工程技术对酵母菌进行改造,以提高它们的木糖发酵能力成为目前研究和开发的重点。 实验室前期已构建了带Candida shehatae木糖还原酶基因xy11的重组表达质粒pACT2-xyll,运用醋酸锂转化法,将该质粒导入实验室营养缺陷型菌株YS58中得到重组菌YS58-xl。选菌落较大的两株重组菌YS58-xla和YS58-xlb测定木糖还原酶的活性,结果比活力分别为0.26U/mg总蛋白和0.32U/mg总蛋白,是宿主菌木糖还原酶比活力的162.5倍和200倍,说明C.shehatae的木糖还原酶基因xyll在S.cerevisiae YS58中得到活性表达。选取YS58-xlb进行木糖醇发酵实验,结果显示重组菌YS58-x1经92h发酵后,消耗木糖6.688g/L,比宿主菌YS58提高了3.87倍：木糖醇产量为6.22 g/L,比YS58增加了10.5倍。研究结果表明,菌株YS58-xl可以在葡萄糖为辅助碳源时,转化木糖为木糖醇。这一特点对生物质纤维材料的全利用极为有利,因为纤维材料的水解物中总是葡萄糖(己糖)与木糖(戊糖)相伴存在的。 从工业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TMB3000中扩增得到木糖醇脱氢酶基因xyl2;将xyl2与带强启动子PMA1的表达载体pDR195连接得到pDR195-xyl2。将重组表达质粒pDR195-xyl2导入YS58中,得到重组菌YS58-X2。选两株重组菌YS58-x2a和YS58-x2b进行木糖醇脱氢酶活性测定,比活力分别为：0.0656U/mg总蛋白和0.07U/mg总蛋白,分别为宿主菌的16.4倍和17.5倍。说明S.cerevisiae TMB3000的xyl2基因超表达成功。 将pACT2-xyll导入YS58-x2b中,用同时缺亮氨酸(leu)和尿嘧啶(ura)的平板筛选得到重组菌YS58-xl-x2。带有不相容性质粒pACT2-xyl1和pDR195-xyl2的共转化子转接培养8d后,后代菌85％以上仍能在缺leu和ura的平板上生长,即同时含有两种重组质粒。说明在有合适选择压力的情况下,可以保证两种不兼容质粒在共转化子中稳定传代。重组菌子中的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活力与分别表达时的活力相当。重组菌YS58-xl-x2葡萄糖与木糖共底物发酵结果显示,重组菌S.cerevisiae YS58-xl-x2对木糖的利用和乙醇的产率较宿主菌S.cerevisiae YS58都有提高。YS58-x1-x2对木糖的利用最高可达7.983g/L,较宿主菌提高了4.8倍,乙醇产量最高可达14.486 g/L,较宿主菌提高23.5％。说明木糖代谢相关基因在宿主体内得到成功表达,YS58-x1-x2已经能利用木糖产酒精；同时还说明两种不相容性质粒不仅能在S.cerevisiae中共存,而且还可以实现不同蛋白质的在S.cerevisiae中的共表达。本实验构建的重组酿酒酵母为后续重组菌的改良奠定了一定的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1 能源现状

1.1世界及中国能源消费现状和趋势

1.2世界可再生能源发展趋势

2 利用木质纤维素发酵生产乙醇的研究背景及意义

3 木质纤维素

3.1木质纤维素类物质的分布和组成

3.2木质纤维素类物质水解方法

3.3水解副产物的生成

4 利用木糖微生物

4.1微生物发酵木糖生产酒精的代谢机理

4.2可以发酵木糖产乙醇的微生物

5 发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母菌的构建工程

5.1木糖的转运

5.2引入木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的代谢途径

5.3引入木糖异构酶基因的代谢途径

5.4耐毒酿酒酵母的选育

6 重组酿酒酵母的转化方法

7 不相容性双质粒共转化重组菌的构建

8 展望

9 本实验研究内容

第二章材料与试剂

1 实验材料

2 试剂盒

3培养基

4酶，抗生素及试剂

5溶液配制

6主要实验仪器

第三章 方法与步骤

1 Candida Shehatae木糖还原酶基因xyl1在Saccharomyces cerevisiae YS58中的表达

1.1带C.Shehatae木糖还原酶基因xyl1的表达载体pACT2-xyl1导入酿酒酵母

1.2木糖还原酶活性的测定

1.3带木糖还原酶基因xyl1的重组酵母的发酵试验

2重组质粒载体pDR195-xyl2的构建及酿酒酵母木糖醇脱氢酶基因的超表达

2.1酿酒酵母木糖醇脱氢酶基因xyl2的获得

2.2重组酵母载体pDR195-xyl2的构建

2.3重组载体pDR195-xyl2导入酿酒酵母YS58

2.4阳性重组子的筛选

2.5木糖醇脱氢酶活性测定

3带有xyl1和xyl2的重组酿酒酵母的构建

3.1 YS58-x1感受态细胞的制备

3.2.xyl1和xyl2的重组酿酒酵母的构建

3.3带不相容性双质粒重组菌的稳定性研究

3.4双酶重组菌的酶活

4重组菌株YS58-x1-x2的发酵实验

4.1菌种的增殖

4.2 3％葡萄糖+2％木糖发酵实验

5糖和乙醇分析方法

5.1高效液相分析糖浓度

5.2气相色谱分析乙醇浓度

第四章 结果与讨论

1 Candida Shehatae木糖还原酶基因xyl1在Saccharomyces cerevisiae YS58中的表达

1.1重组表达载体pACT2-xyl1导入S.cerevisiae YS58及重组子的筛选

1.2重组子酶活测定

1.3木糖醇发酵实验

2 Saccharomyces cerevisiae TMB3000的木糖醇脱氢酶基因xy12在Saccharomyces cerevisiae YS58中的表达

2.1 Saccharomyces cerevisiae木糖醇脱氢酶基因xy12的克隆

2.2重组酵母表达载体pDR195-xyl2的构建

2.3重组表达载体pDR195-xyl2导入S.cerevisiae YS58

2.4木糖醇脱氢酶活性测定

3带木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2的重组酵母YS58-x1-x2的构建

3.1重组子筛选

3.2带不相容性双质粒重组菌的稳定性研究

3.3重组子双酶活测定

3.4重组菌葡萄糖木糖共底物发酵实验

4讨论

第五章结论

参考文献

附录本文缩写词表

致谢