一种新型犬细小病毒检测方法的建立及初步应用

摘要

建立一种不提取病毒DNA,直接采用样本上清液检测犬细小病毒的TaqMan荧光定量PCR方法.通过扩增CPV NS基因部分片段构建重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR方法;对建立的方法进行反应条件、特异性、敏感性的检测;通过建立的方法对核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR进行对比;最后对临床中疑似的CPV病例进行检测.结果显示,建立的方法特异性好,对犬常见病毒无扩增.该方法检测的灵敏度达101copies·μL-1,方法的批内变异系数为0.09％-1.30％,批间变异系数为0.57％-0.94％,重复性良好.核酸和原液的最低检测浓度均可以达到101copies·μL-1,且原液的荧光定量PCR产物浓度约为核酸的7倍,提示核酸提取过程有大量的损耗.对187份临床病料进行检测,建立的方法共检出128份阳性,与普通PCR和胶体金快速检测板阳性符合率为100％,核酸法与原液法符合率为100％.因此,本试验建立的CPV病料原液TaqMan荧光定量PCR方法与普通PCR和胶体金快速检测板相比,具有阳性检出率更高、准确率更好的特点.检测中省去了核酸提取过程,降低了成本和检测时间,可推广于CPV感染的早期诊断、预防控制、进出口检疫及基础研究.